Hybridization of Nucleic Acids

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1 Hybridization of Nucleic Acids
DNA1 DNA2 RNA Probe 核酸 變性後可再黏合復性，回復原來的雙股核酸。若取兩種不同來源的核酸，經變性後混合在一起，假如兩種核酸的序列同質性高，則可能會雜合為混成的雙股核酸。 也可使用已知序列的核酸小片段，作為探針 (probe) 與 DNA 雜合；一般可先把樣本 DNA 經電泳分離後，轉印至尼龍膜上，再以放射性探針進行雜合，稱之為 Southern hybridization。 RNA 也可以在電泳後，與其互補的 DNA 序列雜合，則稱為 Northern hybridization。 Northern hybridization Southern hybridization Juang RH (2004) BCbasics

2 Preparation of Traditional Nucleic Acid Probe
Amino acid sequence GLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU----- GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC--- Nucleic acid sequence * * * * * * * * Codon degeneracy The nucleic acid sequence is Deduced from amino acid sequence Synthesizing oligonucleotide Chemical synthesis 探針 的來源有很多，上圖舉出一例，說明可以由已知蛋白質的一小段胺基酸序列，回推其核苷酸序列，並依此序列進行人工合成探針。注意對應同一種胺基酸的核酸密碼，可能有數種，例如 Ser 就有 UCU, UCC, UCA, UCG , AGU, AGC 等六種可能，稱為密碼的不確定性 (codon degeneracy)。 這樣合成人工探針就會比較麻煩，有幾個對應之道： (1) 把所有可能的密碼全部合成，也就是說變成是一種混合物，各種可能的序列都有，因此精確度降低；(2) 調查該種生物的密碼使用習慣，並選擇較常使用的密碼，(3) 參考不同生物來源的同一個基因序列，抄襲所用的密碼。 PROBE: GGGGACGAGTCCTCCGTTCT Juang RH (2004) BCbasics

3 DNA Target gene denaturation Single colony Lysed
Probe is labeled with radioactive 32P Hybridization DNA denaturation Target gene Single colony 這段 探針經放射性磷酸標定後，可用在 Southern blotting 上，與未知樣本中的核酸進行雜合反應。目標基因若在細菌中，則必須先把細菌溶解，然後以化學反應使核酸變性露出單股 DNA，則可與探針進行雜合反應。 Lysed Juang RH (2004) BCbasics

4 Colony Is Screened by Hybridization with Probe
Colony hybridization Cover with filter paper Transferring … Autoradiography Collect filter paper Dissolve cell DNA denatured Add probe 探針 雜合反應的做法實例。 菌落在培養皿長出來之後，先以濾紙複印得各菌落，利用氯仿把細菌溶並解釋出核酸，然後變性解開核酸的雙股後，再加入標有放射線的探針，進行雜合反應。 若某菌落中含有目標基因，便會與探針雜合成功，該菌落的位置便會出現放射線影像；然後再回去挑起原來培養皿上面的菌落，大量培養後可純化目標基因。 本圖可接續 N1-27 頁的分子群殖，在培養基生長的各個菌落，可以用探針經雜合反應挑出所要的目標菌落。 Juang RH (2004) BCbasics

5 Biochip Based on Hybridization
Sample DNA Complementary DNA hybridize Biochip Each spot contains known DNA 核酸 晶片的基本原理，就是利用類似 Southern blotting 的核酸雜合反應。但是比起一般的毛細管轉印雜合，有幾點不同：(1) 以極細微的色點替代電泳色帶；(2) 一次可以處理上千萬個核酸色點，因此對同一樣本可有上千萬個測試；(3) 樣本所需的量極小；(4) 偵測方式簡便快速，也配合電腦比對分析。 因此晶片看起來很炫，也有其實質的效用。但晶片最重要的靈魂，還是在那一公分見方的小玻片，上面所點的到底是何種 DNA。也就是說，每一個點上的 DNA 是什麼，才是最重要的決定因素；若這些 DNA 能夠明確指示某種關鍵性疾病的有無，則這塊晶片便是無價之寶。這些重要的 DNA 要從哪裡來？ 當然還是要經由無數的基礎研究，獲得對生物的深刻瞭解後，所得到的基本知識點滴。 因此，晶片製作過程是一種技術 (technology)，而晶片上必須點上何種 DNA，便要靠基礎科學 (science) 來提供，兩者是不一樣的，但絕對相輔相成。 其他很多方面也有類似的情形，例如大學裡的教學與研究必須並進，不能偏廢，大家都知道。 然而，目前台灣有個很嚴重的問題，可能會影響國本。那就是在研究上，大家只重視可以馬上應用的技術，不太支持長期的基礎科學研究；在大學裡，教授又只重視如何發表大量論文 (不管有沒有用)，不太花時間在教學的努力與改進上。 [Friend SH, Stoughton RB (2002 四月) 神奇的 DNA 晶片。科學人 2: 40~48] Signal appears Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31 Juang RH (2004) BCbasics