表观遗传学 Epigenetics.

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1 表观遗传学 Epigenetics

2 　表观遗传学 　　　　　　　（Epigenetics） 　 又称为：表遗传学、外遗传学、后遗传学等

3 A Symphonic Example

4 Epigenetic differences：monozygotic twins

5 一、表观遗传学的概念 1. 概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。
3. 表观遗传学的现象： (1)组蛋白修饰 (2) DNA甲基化 (3) MicroRNA (4) Genomic imprinting …

6 二、表观遗传学的发展历史 年，Conrad Hal Waddington提出现代Epigenetics的概念，认为基因型通过一些“偶然的、不确定的机制”决定了不同的表型 年，Hermann J. Muller发现Position-effect variegation (PEV)——第一种表观遗传学现象 年，R.A.Brink发现paramutation现象 年，Mary Lyon发现X染色体失活现象 年，DNA甲基化的发现 …

7 Waddington's epigenetics
基因型 表型

8 Waddington's epigenetics
基因型 表型

9 三、表观遗传学的研究内容 1. 基因选择性转录表达的调控 2. 基因转录后的调控 3. 蛋白质的翻译后修饰

10 1. 基因选择性转录表达的调控 1). DNA甲基化 (DNA Methylation)
2). 基因组印记 (Genomic Imprinting) 3). DNA甲基化与转座子的稳定性 (Transposon) 4). 染色质重塑 (Chromatin remodeling)

11 DNA甲基化

12 基因组印记 Genomic Imprinting: 两条染色体需要随机沉默其一
Beckwith-Wiedemann Syndrome: 1/15,000 BWS：20%的致死率 BWS: embryonic tumor 1. 小头 2. 巨舌 3. 胎盘增生

13 2. 基因转录后的调控 1. 非编码RNA: e.g., Xist and Tsix 2. MicroRNA 3. Antisense
4. Riboswitch RNAs

14 3. 蛋白质的翻译后修饰 1. 组蛋白的甲基化和乙酰化——Static 2. 组蛋白的其他修饰——Dynamic 3. 非组蛋白的共价修饰

15 DNA甲基化 (1) 1. DNA甲基化：在DNA甲基转移酶 (DNA methyltransferase, DNMTs) 的作用下，将一个甲基添加的胞嘧啶的5’-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶 (5-methylcytosine) 2.胞嘧啶甲基化后产生5-甲基化胞嘧啶能够自发的脱氨基形成胸腺嘧啶 (Thymine)：5mC -> T 3. 哺乳动物中，~1%的DNA碱基能够发生甲基化修饰 4. DNA甲基化的分布： (1)转座子 (2) 逆转录病毒衍生的重复序列 (3) 大多数功能基因的编码区

16 C –> 5mC –> T? ? 5-Methylcytosine (5mC)

17 DEAMINATION Deamination: 去氨基化反应
An enzyme to remove it from DNA: uracil-N-glycosylase.

18 DNA甲基化 (2) 1. DNA甲基化的模式： 2. CpG – Cytosine phosphate Guanine
(1) 线虫：无甲基化的胞嘧啶 (2) 果蝇：极少量的甲基化胞嘧啶，识别模式CpT (主要) vs. CpG (极少) (3) 哺乳动物：CpG (~70%)或者CpNpG 2. CpG – Cytosine phosphate Guanine 3. 镶嵌的甲基化 (mosaic methylation): 基因组中，高度甲基化的部分DNA序列被大的非甲基化DNA序列所分隔开 4. 难以被DNA修复系统所识别： CG→TG是可遗传的

19 CpG岛的甲基化 (1) 1. CpG岛：富含CpG区域，长度500~1000bp，GC含量超过55%
2. 非随机出现：~60%的编码基因的5’UTR区域（转录起始区域）含有CpG岛。 3. CpG的含量： (1) CG出现的期望值（百分比）：1/16 = 6.25% (2) 观察值：很少（~1%） (3) 原因：CG具有很高的突变率 4. C-T转换率是其他碱基对转换率的10-40倍以上 5. 例如：人类肿瘤细胞中的p53基因，50%的点突变都发生在CpG上。

20 CpG岛的甲基化 (2) 1. CpG在重复片段以及基因的3’UTR区域能够发生甲基化 2. CpG岛通常不被甲基化

21 DNA甲基化的检测 1. 传统实验方法 Methylation-sensitive restriction enzymes Methylation-specific enzyme McrBC 2. 现代方法 MeDIP: methylated DNA immunoprecipitation assay MBD：methylation binding domain 3. DNA甲基化位点的确定：Bisulfite genomic sequencing Methylation-sensitive restriction enzymes: This method uses methylation-sensitive restriction enzymes, to cleave DNA at specific methylated-cytosine residues which have lost their methyl group, that are followed by a guanine, CpG, followed by amplification of the resultant products. The amplification products are only detected when digestion of the products are inhibited by methylation being present. This method, because of the PCR used to amplify small amounts of DNA, is highly sensitive. Its major disadvantage is incomplete digestion of the DNA material by the restriction-enzymes that will result in false-positives. It is therefore crucial to fully digest the DNA prior to PCR amplification.

22 DNA甲基化的检测 传统方法的缺点：识别特定的motif。

23 Bisulfite Modification
测序: 非甲基化的C将被测序成T 而甲基化的mC在一定实验条件下可保持不变

24 DNA甲基化位点鉴定的方法

25

26 基因调控模型 1. DNA甲基化的主要功能：转录沉默 (silencing transcription)
(1) 基因的启动子区域通常不被甲基化修饰 (2) 建立特定的基因表达模式：组织特异性、生殖特异性… (3) 基因印记、X染色体失活 2. DNA甲基化抑制基因转录的机制： (1) 干扰转录因子对DNA元件的识别和结合 (2) 将转录因子的DNA识别序列转变为阻抑物的识别序列 (3) DNA甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子 3. DNA甲基化：是转录沉默的结果和维持，而不是原因

27 DNA甲基化抑制基因转录的机制 Long-term silencing

28 直接干扰机制

29 真核生物的DNA甲基转移酶 1. 哺乳动物: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B，DNMT3L, DNMT2
2. 拟南芥：DRM2, MET1，DNMT2, CMT3 3. 粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa): DIM2, dim-5, RID

30 DNA甲基转移酶

31 DNA甲基化与去甲基化

32 DNA甲基转移酶的功能 DNA甲基转移酶 物种 主要功能 DNMT1 哺乳动物 Maintenance，de novo (CpG)
DNMT3A de novo (CpG) DNMT3B DNMT3L DNMT3辅助因子，无活性中心 DNMT2 tRNAAsp的甲基化 DRM2 拟南芥 de novo (CpN) MET1 Maintenance (CpG) 未知 CMT3 Maintenance (CpNpG) DIM2 粗糙脉孢菌 RID RIP 必须

33 DNA甲基化：Cell Memory

34 DNA去甲基化 1. DNA去甲基化 (DNA demethylation): 5甲基胞嘧啶 (5mC) 替代成胞嘧啶的过程 2. 两种方式
(1) 主动去甲基化 (Active DNA demethylation) A. Bona fide demethylation B. Indirect demethylation (2) 复制相关的去甲基化 (Replication-coupled DNA demethylation)

35 正常细胞中的表观遗传特征 1. 在人中，DNA甲基化通常发生在-CG-序列上 (CpG)；
2. 富含CpG的区域称为CpG岛，这些区域通常定位于基因的5’端非编码、调控区域； 3. CpG岛通常不发生甲基化修饰， 4. 有些基因启动子的CpG岛可以发生甲基化 A. 组织表达特异性基因的调控，MASPIN (血清蛋白酶抑制剂家族的成员) B. 生殖系基因，MAGE，在几乎所有的组织中沉默，而在恶性肿瘤中表达

36 肿瘤中的DNA低甲基化 1. 在肿瘤细胞中，整体的DNA的甲基化水平显著降低
2. 去甲基化区域：重复片段；编码区以及内含子——产生可变剪切异构体 3. 基因丰富低的区域发生显著的去甲基化 4. 在肿瘤发育过程中，DNA甲基化程度的降低使得进一步损伤加剧，促进从良性扩增到恶性扩增的转变

37 DNA低甲基化 vs. 癌症 1. DNA低甲基化/去甲基化对癌症细胞发育的作用：
B. 激活转座元件 C. 印记的缺失 2. 甲基化水平较低的DNA区域在有丝分裂过程中容易发生重组，从而产生删除或者移位，或者染色体重排 3. DNA低甲基化损坏基因组印记

38 DNA低甲基化促进染色体不稳定性与癌症发生
A. DNA低甲基化降低小鼠的生存率； B. DNA低甲基化的细胞中染色体不稳定性升高(~2.2倍) C. 染色体不稳定性

39 Dnmt敲除：染色体不稳定性 Dnmts敲除的细胞中出现染色体的非整倍现象

40 特定基因甲基化状态的缺失 1. 睾丸特异性的基因、黑素瘤相关基因以及与增殖相关的基因，在体细胞中被沉默，其启动子CpG岛被甲基化
2. 在某些癌症细胞中，这些启动子发生去甲基化，从而使得这些基因能够表达 3. 甲基化水平降低促使基因的表达 A. PAX2，与增殖相关的转录因子 B. let-7a-3 miRNA基因，与子宫内膜癌症和直肠癌等有关

41 肿瘤抑制因子的失活 1. 肿瘤抑制因子基因的启动子CpG岛区域的过甲基化是多数癌症的起始的一个主要事件
2. 眼癌抑制基因 (retinoblastoma tumor-suppressor gene, Rb)的过甲基化 3. 其他肿瘤抑制因子的过甲基化：VHL, p16INK4a, hMLH1, BRCA1等

42 DNA损伤修复相关的基因 1. 启动子CpG岛的过甲基化影响与细胞周期、DNA损伤修复、致癌物质代谢、细胞-细胞相互作用、凋亡和血管生成等方面的基因 2. 过甲基化在癌症的各个时期出现，并与遗传损伤共同出现 3. 例如，DNA损伤修复相关的基因hMLH1, BRCA1, MGMT; 与Werner‘s syndrome相关的基因WRN 4. DNA损伤修复基因的沉默阻止对遗传错误的纠正，从而使得癌症的转化顺利进行 5. 肿瘤抑制因子的甲基化具有癌症类型的特异性 6. 每一种癌症具有特定的“hypermethylome” 7. 肿瘤细胞中，一般 个CpG岛发生过甲基化

43 组蛋白的共价修饰

44 Histone variants

45 组蛋白修饰 Adapted from Lund and Lohuizen Genes Dev 2004

46 组蛋白的乙酰化 1. 通常发生在蛋白质的赖氨酸(K)上； 2. 可逆的生化反应：
A. Histone acetyltransferase，HAT (>30) B. Histone deacetylase, HDAC (18) 3. 分子效应：中和赖氨酸上的正电荷，增加组蛋白与DNA的排斥力 4. 生物学功能： A. 基因转录活化 B. DNA损伤修复

47 组蛋白的乙酰化 中和赖氨酸的正电荷，C=O具有一定的负电，能够增加与DNA的斥力，使得DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化

48 HATs：转乙酰基酶

49 蛋白质乙酰化调控基因转录 A. 乙酰化转录因子，使之与DNA结合能力增强； B. 转录因子活化的结构域招募HATs复合物；
C. HAT复合物乙酰化组蛋白，打开染色质； D. 转录激活； E. HAT复合物中的共激活子也被乙酰化修饰； F. HAT复合物乙酰化之后离开，转录活性削弱。

50 HDACs（Histone deacetylases)

51 乙酰化与去乙酰化 转录因子招募HDAC抑制基因表达； 招募HAT复合物激活基因表达。

52 HDAC Inhibitor 1. 主要针对Classical HDACs； 2. 激活保护性基因的表达 3. 抗肿瘤新药

53 组蛋白的甲基化 1. 主要发生在赖氨酸(K)或精氨酸(R)上； 2. Long-term；
3. HKMTs (histone lysine methyltransferases) vs. PRMTs (protein arginine methyltransferases) 4. 可逆的生化反应? 5. 分子效应：增加赖氨酸上的疏水力 6. 生物学功能： A. 基因转录活化 B. 基因转录沉默 C. X染色体失活 D. 异染色质致密状态 (heterochromatin compaction)

54 Lysine Methylation 1. Mono-, di- or tri- methylation
2. H3K9 & H3K27的tri- methylation是沉默的异染色质的主要特征 3. H3K9的di- methylation对于常染色质的基因表达是必需的 4. H4K20的tri- methylation是癌症中的一个普遍现象 5. 有丝分裂期间，在动粒(centromere)附近的H3K9的tri- methylation负责保证染色体顺利完成分裂 6. 在活化基因的5’端和启动子区域，甲基化出现的模式为： A. H4K20的mono- methylation B. H3K4的di- or tri- methylation C. H3K79的di- methylation

55 Histone Modification Status Correlates with Transcriptional Activity
Gene activation correlated with H3-K9 acetylation Gene silencing associated with H3-K9 methylation

56 异染色质与常染色质的基因沉默 A. 异染色质沉默：组蛋白去乙酰化；甲基化H3K9；招募HP1；形成异染色质
B. 常染色质沉默：转录因子E2F通过Rb招募HP1-Suv29h1；Suv29h1甲基化H3K9；HP1与H3K9结合，沉默基因的表达

57 H3磷酸化的功能：基因表达

58 H4S1的磷酸化 常染色质的H4S1被磷酸化之后 A. 直接形成致密的异染色质； B. 招募HP1，形成异染色质；
C. 促使组蛋白异构体的替换。

59 组蛋白的泛素化 1. 通常发生在赖氨酸(K)上； 2. 可逆的生化反应： 3. 分子效应：小蛋白质，可能改变底物的结构 4. 生物学功能：
A. E1, E2 & E3 B. DUBs 3. 分子效应：小蛋白质，可能改变底物的结构 4. 生物学功能：

60 组蛋白的SUMO化 1. 通常发生在赖氨酸(K)上； 2. 可逆的生化反应： 3. 生物学功能： A. E1, E2, & E3
B. SENPs 3. 生物学功能： A. 转录沉默 B. 抑制组蛋白的乙酰化和甲基化

61 组蛋白修饰之间的关系 1. 组蛋白H3K27的乙酰化促进H3K17的甲基化； 2. H3K9的甲基化与H3S10的磷酸化之间存在竞争关系；
…

62 组蛋白修饰的功能 1. H3K4的甲基化招募NURF促使染色质重塑，使得转录活化；
2. H4K20的甲基化与H2A的磷酸化招募Crb2，负责G2/M的阻断及DNA修复 3. H3K4的甲基化招募乙酰转移酶，进一步乙酰化H4，使得染色质构象打开

63 组蛋白密码 Histone code: The histone code hypothesis predicts that the post-translational modifications of histones, alone or in combination, function to direct specific and distinct DNA-templated programs.

64 组蛋白密码 A. 修饰结合蛋白质：组蛋白密码的阅读器 B. 组蛋白密码的组合方式 C. 不同组蛋白的修饰组合起来发挥功能

65 组蛋白密码的擦除 1. 对于活化的基因，Ub将H3切断，去除乙酰化修饰的N端，在HDAC的作用下，关闭基因

66 常染色质 vs. 异染色质 Ac: 乙酰基　　Me:甲基　　P：磷酸基

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68 活性染色质的产生 组蛋白的乙酰转移酶的结合活化相应区域 去凝聚状态的染色质

69 组蛋白去乙酰化酶 染色质重塑复合物 组蛋白乙酰化酶 染色质重塑复合物

70 癌症细胞中的组蛋白修饰 1. 组蛋白修饰变化的检测——质谱学方法 2. 组蛋白的修饰具有多样性
3. 在癌症细胞中，肿瘤抑制因子CpG岛的过甲基化，相关的组蛋白修饰有： A. 组蛋白H3和H4的去乙酰化 B. H3K4三甲基化的缺失 C. 获得H3K9的甲基化和H3K27的三甲基化 4. H3和H4的去乙酰化和过甲基化抑制肿瘤抑制基因如p21WAF1的表达，尽管该基因的CpG岛不发生甲基化修饰

71 表观遗传变化的检测 质谱学的方法检测癌症细胞中组蛋白修饰的改变

72 组蛋白修饰：正常细胞 vs. 癌症

73 癌症细胞中的组蛋白修饰 1. 肿瘤细胞中，H4缺失单乙酰化和三甲基化修饰 2. 在肿瘤发育的过程中，该修饰水平的降低将持续积累
3. 单乙酰化的缺失：Lys16，三甲基化的缺失：Lys20；两种修饰的缺失与DNA重复片段的低甲基化伴随出现 4. H4的修饰缺失至少在乳腺癌和肝癌中发生 5. 在前列腺癌中，H3K4的去甲基化与H3K18的乙酰化是该癌症发生的分子标记

74 组蛋白修饰因子的遗传损伤 1. 组蛋白修饰因子的表达谱在癌症细胞中具有特异性，并且与正常细胞的表达截然不同
2. 在白血病和肉瘤中，组蛋白修饰因子发生染色体移位： A. 组蛋白乙酰转移酶 (CREB, CBP-MOZ) B. 组蛋白甲基转移酶 (MLL1, NSD1, NSD3) 3. 固体瘤中，组蛋白修饰因子发生扩增 A. 组蛋白甲基转移酶EZH2, MLL2, NSD3 B. 组蛋白去甲基酶Jumonji domain-containing protein 2C (JMJD2C/GASC1)

75 四、表观遗传学与遗传学 1. 表观遗传学是经典遗传学的补充和进一步的发展； 2. 拉马克的进化学说:
(1) 用进废退 (2) 获得性遗传 3. 表观遗传学仅见于真核生物中，遗传模式有： (1) 稳定模式 (2) 动态模式/衰减模式 (可逆的)

76 五、表观遗传学对医学的影响 1. 环境对基因表达的调控作用 表型=基因型+环境 2. 环境因素对人的影响 3. 表观治疗 (1) 癌症
(2) 衰老 (3) 心血管疾病 (4) 自身免疫性疾病 (5) 心血管疾病 3. 表观治疗

77 表观遗传与癌症 DNA甲基化 肿瘤细胞： 甲基化程度低：染色体容易发生功能异常
(1) 高甲基化 (Hypermethylation)：基因表达量低 (2) 低甲基化 (Hypomethylation)：基因表达量高 肿瘤细胞： (1) 整个基因组甲基化程度很低 (2) 某些抑癌基因错误的发生甲基化被沉默 甲基化程度低：染色体容易发生功能异常

78 1. Dnmt1chip/-: Dnmt1的表达量为正常小鼠的10%；
2. 低甲基化 3. Dnmt1chip/-小鼠出生体重为正常的70% 4. 80%的小鼠4-8个月内产生淋巴瘤 5. 癌基因c-myc表达量异常增高

79 各种癌症细胞中的表观遗传的异常 表观遗传的异常同时伴随着遗传学的缺陷——相互作用

80 表观治疗 1. DNA甲基化抑制剂 2. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (1) CpG岛的异常甲基化：癌症发生早期
(2) 小分子抑制剂：特异性不高 (3) 研究前景：选择性抑制甲基化，激活保护性基因 2. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (1) 组蛋白的乙酰化酶 (HATs)：增强转录因子活性 (2) 组蛋白的去乙酰化酶 (HDACs)：减弱转录因子活性 (3) 抑制去乙酰化：增强转录保护性基因 (4) 对特异性要求不高

81 六、国际人类表观基因组计划 1. The Human Genome Project: provides the blueprint for life, but the epigenome will tell us how this whole thing gets executed. 2. Human epigenome project: DNA methylation (1) 不同组织、细胞 (2) 不同发育阶段 (3) 正常细胞 vs. 癌症、疾病细胞

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83 小　结 染色质的基本结构　常染色质　异染色质 常染色质与异染色质之间的动态转换 表观遗传学　DNA甲基化　组蛋白修饰（乙酰化）　X染色体失活