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中国医科大学 卫生部细胞生物学重点实验室 教育部医学细胞生物学重点实验室 医学基因组学教研室 主讲: 罗阳 教授
分子生物学基本技术课程简介 中国医科大学 卫生部细胞生物学重点实验室 教育部医学细胞生物学重点实验室 医学基因组学教研室 主讲: 罗阳 教授
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课程主要讲授内容 分子生物学前沿技术应用 分子生物学基本技术 分子生物学技术在科研设计中的应用（实验课讲授） 基因数据库的应用
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主要实验内容(基因组实验室 综合楼15楼) 基因组DNA提取 PCR反应 琼脂糖凝胶电泳 目的基因克隆片段的回收和纯化
目的基因与克隆载体的连接、转化和筛选 RNA的提取 RT-PCR的原理和步骤 Southern印迹杂交 Western印迹杂交
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分子生物学前沿技术介绍
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讲授内容 LCM(laser capture microdissection)
DHPLC（Denaturing High Performance Liquid Chromatography） MLPA（Multiplex ligation-dependent probe amplification） The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
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LCM(laser capture microdissection)研究技术体系
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DHPLC（Denaturing High Performance Liquid Chromatography）技术分析系统
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Demonstration of temperature selection based on melting curve
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Three Modes of DHPLC Operation
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DHPLC原理 DHPLC技术是利用液相色谱技术， 在高压 闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在
缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度 条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测 或荧光检测被分离的DNA样
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DHPLC检测流程图 变性高效液相色谱 是一种检测微小突 变的高敏感性，高 精确性和高通量自 动化技术
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野生型和突变型PCR产物等体积混合，进行变性和复性形成异源双链，进行DHPLC检测
异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分解链，由于单链DNA所带负电荷减少，结合力弱，因此，在洗脱剂乙氰的作用下异源双链比同源双链先于分离柱上洗脱出来，从而识别变异型 同源双链
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图A，患者同正常对照的单峰相比，出现肩峰
B control patient 图B，对异常峰型样品的测序结果 图A，患者同正常对照的单峰相比，出现肩峰
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MLPA（Multiplex ligation-dependent probe amplification）结合毛细管电泳技术检测基因突变
CEQ8000遗传分析仪
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MLPA技术应用范围 MLPA是一种灵敏度极高的相对定量技术，是利用简单的杂合(hydriation)、连接(ligation)及PCR增幅(PCR amplication)反应，于单一反应管內可同时检测最多40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。 应用于染色体数目异常(Trisomy13、18 & 21)、遗传疾病基因缺失重复(如SMA、DMD基因…等)、基因甲基化检测(如Prader-Willi syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS)、抑癌基因诊断(如Breast cancer、Lung cancer…等)及mRNA分析等。检测探针种类，已超过上百种。
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MLPA的技术优势 灵敏度高(High Sensitive) ：MLPA每次反应只需大约20 ng的DNA或10 ng的 RNA即可，为Southern-blots及微阵列(micro-arrays)反应所需的1/100~1/1000，且无须准确定量。 专一性高(Specific) ：利用MLPA可检测序列中单一核苷酸的改变，但需要进一步验证。 再现性高(Reproducible)： 利用 ng之DNA进行检测，其每一个探针的变异系数(Coefficient of variability)仅3-8%。 简单(Simple) ：每一反应只需在同一PCR管內仅行，可获得多达30-40个讯号值，这个反应中已经包含了內控制组，重复组及检测的目的基因，可用于进行反应的监控。 高处理速度(High Throughput) ：MLPA搭配自动化设备，可在三小時内同时处理96个检测。检测从DNA提取、反应至结果分析，仅需兩个工作日。此外，因为所使用的反应条件都相同，可以平行处理不同的检验项目。
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MLPA 原理 探针构成 PCR引物X 填充序列 杂交序列 M13-derived oligonucleotide 60-450 bp
Synthetic oligonucleotide 50-60 bp PCR引物Y
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MLPA 反应过程 1、多对探针同时与靶序列杂交 2、连接酶连接
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MLPA 反应过程 3、PCR扩增 4、毛细管电泳检测 通用引物X和Y进行PCR扩增
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连续多外显子缺失突变 连续多外显子重复突变
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患者和携带者检测结果 患儿 患儿母亲 患儿和患儿母亲的MLPA结果显示相同的重复区域
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荧光显微分析系统
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实验课教学团队和教学画面
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