Transgene induce gene silencing (TIGS)

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1 Transgene induce gene silencing (TIGS)
植物生理學實驗 9 轉基因誘導基因靜默 Transgene induce gene silencing (TIGS) 授課教授：傅士峯老師 助教：呂學宇、張凱雅 值日組：G9 105/5/11

2 實驗目的 了解轉基因誘導基因靜默 了解綠螢光蛋白和螢火蟲發光原理 了解基因轉殖法 實務操作轉基因誘導靜默

3 實驗原理

4 ? 轉基因誘導基因靜默 Transgene induce gene silencing, TIGS Chalcone synthase
首次發現於矮牽牛轉殖株 (Jorgensen et al., 1990) Chalcone synthase (CHS) is the key enzyme in flavonoid biosynthesis. It catalyzes the condensation of one molecule of 4-coumaroyl-COA with three molecules of malonyl-COA to form naringenin chalcone, which is the central intermediate in the biosynthesis of flavonols, flavones, isoflavonoids, and anthocyanins Chalcone synthase Overexpress ? Silencing

5 Post-transcriptional gene silencing
轉基因誘導基因靜默原理 - P T G S Post-transcriptional gene silencing LB RES 35S nos UV RB GFP GFP transcription mRNA transcription GFP A AAA . . . . A AAA RdRP Dicer=r=RNaseIII family 查外切酶 dsRNA RdRP RISC silencing Dicer Dicer cleavage UV RISC RdRP : RNA-dependent RNA polymerase RISC : RNA-induced-silencing complex

6 綠螢光蛋白 Green fluorescent protein, GFP
1962 年下村脩等人發現自維多利亞多管發光水母 (Aequorea victoria) 2008 年諾貝爾化學獎 常被做為報導基因，驗證研究假說 水母發光原理 分子量 27 kDa,常被作為報導基因 下村脩、馬丁·查爾菲及錢永健博士因綠色螢光蛋白的發現與改量，而獲得 2008 年諾貝爾化學獎

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8 GFP 激發光譜與發散光 激發光譜 發散光 (綠螢光) 激發光譜

9 補充：螢光素酶 Luciferase 螢光素酶是能催化受質，使其發生氧化，進而發散出螢光的酵素之總稱 存在於許多昆蟲、海洋生物、原核生物均
例：螢火蟲螢光素酶 (firefly luciferase, FL) 在植物中半衰期短 (3.5 h)，具高靈敏度 Fly liciferase由單一多肽組成,在mg2+,ATP,O2存在時,催化D-luciferin氧化脫羧發光（ nm） 半衰期短,啟動子的改變會即時導致螢光酶活性改變,而螢光素不會累積 需加入特定螢光素酶底物,螢光素酶與底物反應,產生螢光,通過檢測螢光強度,可以測定螢光素酶的活性,以判斷轉錄因子是否能與此基因片段相互握用

10 Systemic gene silencing
UV 35S RB LB GFP nos 綠螢光 注射葉 綠螢光加強 GFP GFP GFP GFP 16C 16C 16C 16C Overexpression GFP Agroinfiltration PTGS GFP Systemic PTGS 觀察 日期 5/16 (一) 5/18 (三) 5/25 (三)

11 農桿菌介導轉型法 (Transformation)
T-DNA (transferred-DNA) 在染色體隨機插入 35S RB LB GFP nos

12 實驗步驟 基因轉殖 ：注射農桿菌 (35S::GFP) 至 16C 葉片 觀察螢光：WT (葉綠素螢光) v.s. 16C (GFP)
觀察螢光 ：5/16 (一) 、5/18 (三) 、5/25 (三) 35S RB LB GFP nos Agro- 35S::GFP Agroinfiltration

13 問題討論

14 報告繳交 報告格式：實驗目的、原理、結果、問題討論、補充資料、心得 繳交期限：6/1 課程結束前