微生物细胞表面展示在生物除污方面的应用 闵少颖

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1 微生物细胞表面展示在生物除污方面的应用 闵少颖 10708057

2 引言 细胞表面展示系统的应用 几种不同的细胞表面展示系统 总结与前景展望

3 1 引言：利用重组DNA技术将不同蛋白展示在微生物细胞表面作为一种新的生物除污方法已经出现，并且已经研究了细菌和酵母在这方面的应用。细胞表面展示的特定蛋白使工程微生物能够转运、生物聚集重金属或使重金属解毒，也能降解外源性化学物质。本文介绍了微生物细胞表面展示技术在通过金属结合蛋白增强重金属的生物聚集方面的应用，同时也讨论了通过酶或微生物细胞表面的蛋白降解外源性化学物质。

4 微生物表面展示技术是一种新的基因工程技术, 它使表达的外源肽以融合蛋白形式展示在噬菌体或微生物细胞的表面, 被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。随着展示技术的发展, 人们可以更有效的认识、改造和创建各种生物大分子。改造细胞表面结构, 比改造细胞其他部位结构更容易实现, 因此也就更接近实际应用。通过表面展示技术制备细胞表面吸附剂, 可在重金属污染去除和毒性有机污染物的脱毒等环境保护领域以及生物传感器和金属溶出等方面得到应用。微生物细胞表面展示技术还可以应用于开发活的细菌疫苗、筛选抗体库、生产生物细胞吸附剂以及制备整细胞生物催化剂。通过金属高效结合肽的肽库筛选和微生物展示技术，将金属结合肽直接展示在微生物的表面，用于处理环境中的重金属污染，为环境中重金属污染的防治提供了一条新的途径。

5 2.1细胞表面展示增强重金属的生物富集 将富含组氨酸和半胱氨酸金属结合短肽通过与膜蛋白OmpC和麦芽糖孔蛋白（ LamB ） 融合展示在细胞表面的研究已有许多报道。Sousa等将六聚组氨酸通过LamB 展示在大肠杆菌表面,重组菌对Cd2+的吸附和富集能力增加10倍,不过这种工程菌对重金属的吸附缺乏专一性,除吸附Cd2+外,还可结合Zn2+ 、Cu2+ 、Ni2+等. Kotrba等将Gly - His - His - Pro- His - Gly (用HP表示)和Gly - Cys - Gly - Cys - Pro - Cys -Gly - Cys - Gly (用CP表示)分别与LamB融合展示在大肠杆菌表面,展示HP的菌株对Cd2+的结合能力增加1. 8倍,展示CP的菌株对Cd2+的结合能力增加4倍. Samuelson等发现将His3 - Glu - His3和His6与葡萄球菌蛋白（SpA）融合表达后能增强葡萄球菌(S. xy losus和S. carnosus)与Ni2+和Cd2+的结合能力. Xu等将长达162个氨基酸的多聚组氨酸与OmpC融合,重组菌株吸附Cd2+的能力达32mol/g干菌.

6 将酵母和哺乳动物的金属硫蛋白(metellothioneins,MTs)展示在大肠杆菌细胞表面也已有不少成功的例子金属硫蛋白富含半胱氨酸,能结合金属离子使其失活. Sousa等将酵母和哺乳动物的金属硫蛋白与LamB融合,并表达展示在大肠杆菌细胞表面,重组菌结合Cd2+的能力增强15～20倍,Valls等和Kotrba等报道了类似的试验结果. 但是这类重组菌不适用与原位土壤修复. 假单孢菌( Pseudom onas) 具有旺盛生长能力、能在高度污染的环境中生长,具有生物修复应用的潜力.Valls等将小鼠MTs与奈瑟氏球菌(N eisseria) IgA蛋白酶β- 结构域融合,并在恶臭假单孢杆菌( P. putita)中表达,结果重组菌的重金属结合能力增强3倍.

7 植物螯合素( PCs)是植物和真菌中天然存在的金属结合肽,含(Glu - Cys) Gly结构,其金属结合能力比金属硫蛋白强,Bae等将合成的PCs展示在摩氏杆菌细胞表面,重组菌与汞的结合能力增强10倍.金属结合短肽、金属硫蛋白、PCs结合金属离子的选择性较差,难以满足特殊要求. 其实自然界存在许多有高度专一性的金属结合蛋白,许多细菌可经诱导产生代谢和失活重金属毒性的运输蛋白和酶,例如最近Bae等把金属调控蛋白(MerR)与冰晶蛋白（NP）融合,使MerR展示在大肠杆菌细胞表面,这样得到的重组菌,其Hg2+结合能力比野生型大肠杆菌JM109高出6倍. 而且,对Hg2+有很强的专一性,对离子农度、pH值和金属螯合剂不敏感,在超出Hg2+浓度100倍的Cd2+和Zn2+存在的情况下,重组菌对Hg2+的吸附没有明显的减弱.

8 2.2 细胞表面展示增强外源性化学物质的生物降解作用
有机磷农药是目前使用最广泛的农药, 占农药总量的80% ,也是毒害最大的农药之一,是一种神经毒素,可引起乙酰胆碱积累,干扰肌肉反应. 从土壤微生物中分离的有机磷水解酶(OPH)能有效地降解有机磷农药,降低其毒性,如对硫磷和甲基对硫磷经OPH水解后毒性降120倍. 但是,用分离纯化的OPH来消除环境中有机磷农药的毒性显然是不现实的,用整细胞进行污染物脱毒费用也很高,而且有机磷难以透过细胞膜,效率很低. Richins等研究表明,表面展示OPH的工程菌降解对硫磷和对氧磷的速度是胞内表达OPH菌株的7倍,而且比纯化的OPH更稳定.

9 尽管酶水解能使对硫磷和甲基对硫磷等有机磷农药的毒性下降120 倍,但其降解产物P - 硝基苯酚（PNP)仍被认为是环境污染物
尽管酶水解能使对硫磷和甲基对硫磷等有机磷农药的毒性下降120 倍,但其降解产物P - 硝基苯酚（PNP)仍被认为是环境污染物. PNP不像有机磷农药,它在水中的溶解度很高. Spain和Gibson发现摩拉克氏菌能以PNP为唯一碳源,具有降解PNP的能力. Shimazu 等通过INP将OPH展示在摩拉克氏菌细胞表面,使单一工程菌具备同时降解有机磷农药和PNP的能力,工程菌降解甲基对硫磷和对硫磷的速率分别为0. 6μmol h-1 mg-1和1. 5μmol h- 1 mg- 1 ,约比野生菌高10倍,工程菌降解PNP的速率与野生菌相同.

10 3.1革兰氏阴性菌表面展示系统 革兰氏阴性菌展示系统的宿主细胞主要是大肠杆菌，载体蛋白大部分都是利用外膜蛋白开发的。革兰氏阴性细菌展示系统中主要应用N端融合，C端融合，插入融合三种融合方法。

11 　3.2革兰氏阳性菌细胞表面展示系统 革兰氏阳性菌作为表面展示系统与革兰氏阴性菌相比具有：① 外源蛋白只需转运透过一层膜, ②生长快, ③目前使用的木糖葡萄球菌(S. xy losus)和山羊葡萄球菌(S. carnosus)为安全的非病原菌等优点。 革兰氏阳性细菌的许多表面蛋白与细胞壁以共价键的方式结合从而固定在细胞表面, 这些蛋白通常有个特异性的信号肽, 革兰氏阳性细菌细胞表面展示系统的可用的融合方法有N端融合和C端融合。葡萄球菌蛋白（SpA）被作为一个典型载体蛋白系统来研究细胞表面蛋白在革兰氏阳性细菌中的转运和定位机理。除了葡萄球菌蛋白外, 还有其它一些载体序列被用来在革兰氏阳性细菌表面展示外源蛋白。

12 3.3 酵母菌表面展示系统 酵母细胞表面展示系统中宿主细胞一般为酿酒酵母, 载体蛋白主要是酿酒酵母细胞表面的两类甘露糖蛋白:SDS可提取甘露糖蛋白和葡聚糖酶可提取甘露糖蛋白。前者是以非共价键的方式与细胞壁结合, 经SDS和还原剂处理后就能从细胞壁上释放出来。后者以共价键的方式与细胞壁交联, 只有当细胞壁经过葡聚糖酶处理后才能从细胞壁上释放出来。

13 4 微生物细胞表面展示的总结与前景展望 尽管人们对细菌表面展示技术用于重金属污染修复做了许多有益的探索,但到目前为止,该领域的研究大多仍停留在实验阶段,离应用尚有一段距离。主要因为存在以下问题: (1)天然金属结合蛋白往往过大或表达活性较低; (2)目前了解的载体蛋白往往仅适用于有限的宿主菌,应用潜力有限; (3)用于表面展示的目的菌十分有限,而真正具有应用意义的微生物,往往因为遗传背景不清晰,或其蛋白质表达过程及生化代谢途径不了解而无法运用。

14 寻找天然的具有重金属抗性或重金属耐受性微生物以及在广泛环境中都可以正常生长的微生物将是该领域的一个重要研究方向;建立一种有效的金属结合肽筛选机制,以获得高亲和力、强专一性、序列相对较短的金属结合肽;寻找可以用于不同目的菌的载体蛋白将大大提高融合蛋白表达效率;将不同来源的几种靶蛋白展示于同一目的菌表面,以期获得多功能重金属结合菌,仍是一个挑战。

15 谢谢!