转基因和基因敲除技术介绍 张 晓 军 刘 杰 魏 岱 旭.

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1 转基因和基因敲除技术介绍 张 晓 军 刘 杰 魏 岱 旭

2 主要内容 转基因技术 基因敲除技术 文献

3 一、转基因（Transgenesis）技术
定义：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的技术 微生物中的基因转移 植物转基因技术 动物转基因技术

4 1、微生物中的基因转移 转化 转导 接合 溶原性转换 原生质体融合

5 2、植物转基因技术 农杆菌介导转化法：根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。 基因枪介导转化法：利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中。 花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

6 3、动物转基因技术 显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
体细胞核移植

7 二、基因敲除技术 定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。 1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除

8 1． 利用基因同源重组进行基因敲除 应用最为广泛 其具体的原理和应用将在后面重点介绍

9 2.利用随机插入突变进行基因敲除 ——基因捕获法
利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

10 3.RNA干扰引起的基因敲除 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。

11 基因敲除技术与诺贝尔奖 医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授 摘自《中华医学信息》 年第22卷第21期

12 文献： Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas
putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production 实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因 phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特异性 运用原理： 同源重组的基因敲除

13 Abstract Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chain-length poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from

14 Pseudomonas stutzeri 1317, were expressed in the mutant strains to test the PhaC enzyme substrate specificity. The result showed P. putida KTOY01 or KTOY02 could provide not only mcl PHA monomers but also 3-hydroxybutyrate from fatty acids, which may allow the production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA). Plasmid pCJY10 containing phaC2Ps, phbA, and phbB genes encoding PHA polymerase, b-ketothiolase, and acetoacetyl-CoA reductase, respectively, were transformed into P. putida KTOY01 and KTOY02. Shake-flask culture showed P. putida KTOY01 or KTOY02 (pCJY10) could accumulate poly(3HB-co-mcl 3HA) from glucose. The above result showed pha operon knockout mutant of P. putida KT2442 was a very useful host of great potential not only for studying PhaC synthase, but also for microbial production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA), which is very difficult to abtain.

15 RECOMBINATION

16 A B 目的基因 目的基因 B A、B为一段DNA序列，并非是基因 第一次重组 A1 A2 a b 构建质粒 a1 a2 A1 a2 b

17 B B B2 B1 目的基因 目的基因 第二次重组的第一种情况 A1 a2 a1 A2 b A1 a2 b a1 A2 b1 b2 B1

18 B B A B 目的基因 目的基因 第二次重组的第二种情况 A1 a2 a1 A2 b b A1 a2 a1 A2 A1 A2 目的基因

19 第一次重组 x 第二次重组 目的基因不在基因组上 目的基因还是在基因组上

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23 致谢

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27 转导：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中
普遍性转导 噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程 局限性转导 在转导过程中,如所转导的只限于供体菌染色体上特定的基因,则称为局限性或特异性转导.

28 转染：通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。转染是转化的一种特殊形式。

29 接合：是供体菌通过性菌毛相互沟通，将供体菌的遗传物质（质粒）转移给受体菌。

30 溶原性转换：温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。

31 原生质体融合：将两个不同的细菌在溶菌酶或青霉素作用下，失去细胞壁成为原生质体后进行融合的过程
在聚乙二醇存在下，使两个细胞原生质融合，融合后的细胞形成二倍体细胞，具有两套染色体，表现两者的特征。常用作生物工程的研究

32 补充资料 “基因敲除小鼠”： 他们利用“基因敲除”的方法创造了一套完整的“基因敲除小鼠”的方式，把任意改变小鼠基因变为现实，不仅可以研究单个基因在动物体内的功能，而且为人类攻克某些遗传因素引发的疾病，提供了药物试验的动物模型。 所谓“基因敲除小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰──就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉，然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们就会生出基因完全被“修饰”过的小鼠

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34 PCR B A C 质粒的构建 构建一种质粒敲掉phaZ基因