Native PAGE 马海荣 S 仇黎鹏 S 李小文 S 吴灿 S

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1 Native PAGE 马海荣 S0930597 仇黎鹏 S0930598 李小文 S0930599 吴灿 S0930600
China Pharmaceutical University Native PAGE 马海荣 S 仇黎鹏 S 李小文 S 吴灿 S

2 Contents 1 PAGE基本原理 2 Native PAGE 3 Native PAGE 分类 4 实验操作过程及注意事项

3 1. PAGE 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺：acrylamide，简称Acr N,N-甲叉双丙烯酰胺：N,N—methylene- bisacylamide，简称Bis

4 1. PAGE 过硫酸铵：ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP。AP在水溶液中即可形成一个过硫酸自由基，化学聚合。 核黄素：riboflavin，即vitamin B2，C17H20O6N4。Riboflavin-TEMED系统需要光照和氧气，引起riboflavin分解生成自由基，称为光聚合。 N,N,N’,N’—四甲基乙二胺：N,N,N’,N’—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED

5 1. PAGE TEMED AP+H2O 过硫酸自由基 0-40℃ Bis PAM Acr 交联 聚合 三维网状结构

6 1. PAGE PAGE分离原理： 电荷效应：不同蛋白质所带电荷不同，在电场 中迁移率不同。电荷越多，迁移越快。
分子筛效应：一定浓度的凝胶具有一定大小的 孔径。分子量和形状不同的蛋白质泳动时所 受到的阻滞程度不同，迁移率不同。 浓缩效应：不连续体系由电极缓冲液，浓缩胶 和分离胶组成。浓缩胶和分离胶存在凝胶孔 径的不连续性和缓冲系统（离子成分、pH和 电位梯度）的不连续性。

7 1. PAGE 电泳系统 连续电泳 不连续电泳 PAGE类型 蛋白质电性 阳极电泳 阴极电泳 电泳槽 圆盘电泳 垂直平板电泳 水平平板电泳

8 1. PAGE

9 2. Native PAGE 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS、疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性和构象，对于生物大分子的鉴定有重要意义。

10 2. Native PAGE 影响native PAGE的因素
凝胶浓度：Acr的浓度改变范围为5%~10%， Acr:Bis可从20:1到50:1，引起不同筛分效应。 pH：一般采用pH为8.8，也可在微酸性环境下 电泳，前提是不影响蛋白质的生物活性。 离子强度：过高，电泳时过度发热；过低，出 现非特异蛋白凝集。范围通常在 10~100mmol/L。 温度：所有步骤都要在0~4℃条件下进行，可 保持蛋白质的活性，降低蛋白质的水解作用。

11 2. Native PAGE Native PAGE凝胶 separating gel
Single gel （单一浓度凝胶） Gradient gel（梯度凝胶） 浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶适合分离成分复杂、分子质量范围较大的蛋白，分离效果更好。随着凝胶浓度的逐渐增加，凝胶孔径逐渐减小，不同大小蛋白质分子的移动就会在不同的区域受阻，形成较窄的区带。 需要梯度混合器来完成制胶工作。常用凝胶浓度4%~22%。电泳电压一般在500V左右。

12 3. Native PAGE的分类 Native PAGE Blue native PAGE（BN-PAGE）
Clear native PAGE（CN-PAGE） Quantitative preparative native continuous PAGE（QPNC-PAGE）

13 3. Native PAGE的分类 Blue native PAGE
Blue-native PAGE是PAGE中应用较广的一种， 在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势。 1991年Schagger等人为了研究线粒体内膜中多亚基蛋白复合物建立起的一种温和凝胶电泳系统，它是以考马斯亮蓝G-250代替SDS使蛋白复合物带负电，从而避免了蛋白质的变性。——Blue native PAGE

14 3. Native PAGE的分类 操作过程 样品处理：
加入考马斯亮蓝，其可以与膜蛋白结合消除蛋白疏水性，从而起到增溶作用。同时使膜蛋白带负电荷，电泳时（pH7.0）向阳极迁移。 2. 制胶。 通常在顶部的阴极一侧需要一个梯度为3-5%的丙烯酰胺，在底部的阳极一侧需要梯度为13-15%的丙烯酰胺，适用于10kDa—10MDa的分离，可以通过改变胶的浓度，而改变分离范围。

15 3. Native PAGE的分类 3. 缓冲液： 4. 电泳： 阳极缓冲液;50mM Bis-Tris/HCl PH7.0
阴极缓冲液A: 50mM Tricine,15mM Bis-Tris/HCl，PH %考马斯亮蓝（或不加） 阴极缓冲液B: A+0.02%考马斯亮蓝 4. 电泳： 在4℃进行电泳；先使用阴极缓冲液B，电压设定为100v；等样品进入凝胶后将电压设为500v,待蓝色前沿前进到一半距离处，暂停电泳，将阴极缓冲液吸出，换成A缓冲液；待蓝色前沿到达底部前停止电泳；

16 3. Native PAGE的分类 缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致敏感蛋白复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。 通常与其他电泳联用做二维电泳，甚至三维电泳。

17 3. Native PAGE的分类 2D BN/SDS-PAGE

18 3. Native PAGE的分类 3D BN/IEF/SDS-PAGE.

19 3. Native PAGE的分类 CN-PAGE
在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳技术，没有带电荷染料，而是通过除染色以外的其它方法如与SDS-PAGE或与LC-MS联用鉴定分析蛋白。 分辨率通常比BN-PAGE低。 迁移距离决定于蛋白的固有电荷、大小和形状。

20 3. Native PAGE的分类 当考马斯染料对所要 分析的天然混合物产生干扰时，CN-PAGE就显示出了优势，CN-PAGE可保证蛋白复合物结构和功能的完整性。 如测定催化活性（例如线粒体ATP合酶）或分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。 线粒体ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出，但BN-PAGE无法检出。

21 3. Native PAGE的分类 QPNC-PAGE 是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据 等电点分离蛋白的高分辨技术。
这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性，天 然金属蛋白样品，正确或非正确折叠的与金属 辅助因子结合的可溶性蛋白混合物的鉴定。 金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分 成高纯度的部分，故QPNC-PAGE与其它电泳 技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN- PAGE等相比被称为“突破性的方法”。

22 3. Native PAGE的分类 QPNC-PAGE分离系统
电泳缓冲系统是基于Tris-HCl和NaN3，pH为 10.0，这种条件下大多数蛋白都会带负电荷， 在电场的正负极之间迁移。 在生理PH（8.00）的缓冲体系下蛋白被连续洗 脱并分成不同的部分。

23 3. Native PAGE的分类

24 3. Native PAGE的分类 QPNC-PAGE凝胶特征 聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。
凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最小化。故凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。 待分离的金属蛋白不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。 孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE后不会发生构象变化。

25 3. Native PAGE的分类 B. Kastenholz 对Arabidopsis thaliana（拟南芥）中的一种高分子量（约200kDa）活性镉蛋白分离。先用GPC通过分子量大小进行分离，然后用QPNC-PAGE进行分离，电泳图谱出现单一条带，同时镉蛋白的天然化学结构没有改变，并且蛋白复合物经电泳后并没有解离成金属离子和脱辅蛋白质。 GPC：gel permeation chromatography 凝胶渗透色谱法。

26 3. Native PAGE的分类 QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱 性和中性金属蛋白。
在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结 构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的 金属可能导致蛋白的错误折叠。 QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的 连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关 金属蛋白的生理状态的结构。这一技术可以提高 蛋白错误折叠相关疾病的诊断和治疗水平。

27 4. 操作过程及注意事项 实验准备 保存 上样 检测 电泳 1. 溶液配制 凝胶配制 5. 凝胶保存 4. 染色 2.制备样品 加样
2.制备样品 加样 4. 染色 技术联用 检测 电泳 3. 电泳

28 4. 操作过程及注意事项 实验准备 首先要清楚是分离碱性蛋白还是酸性蛋白。
分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 通常在电泳中采用的pH 的缓冲系统， 蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动； 分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统， 一般采用pH 。通常电泳是在微酸性环 境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极 和阳极倒置才可以电泳分离碱性蛋白。

29 4. 操作过程及注意事项 溶液配制Tips Acr是神经毒剂，戴手套操作。 电泳纯，ddH2O。 胶配制
AP应现配先用；或大量配制，-20℃储存。 最后加TEMED。 可通过调节AP和TEMED的量调节聚合时间。一般聚合时间为20min~60min。 灌胶要迅速，且避免产生气泡。

30 4. 操作过程及注意事项 上样 标准样品（测分子量） 要求在形状大小，水化度方面与待测蛋白比较类似。比较难找。SDS-PAGE。
样品的离子强度不能太高（I<0.1mmol/L），否则会引起电泳条带变形。 上样前一定先要离心，除去沉淀物。 一般来说 marker不是必要的，如果一定要用，可以买一些专门的native PAGE marker。

31 4. 操作过程及注意事项 电泳 预电泳，除去凝胶中没有聚合的单体、双体和 聚合引发剂，提高分辨率，30~60min。
电泳时候电压在100V~200V之间。过高则电泳 时产生的热量太多导致蛋白变性；过低，延长 电泳时间，电泳条带弥散。 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延 长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的 蛋白质分开。

32 4. 操作过程及注意事项 检测 染色：根据蛋白性质，所需灵敏度选用不同染色方法。常用：
考马斯亮蓝。灵敏度为0.2~0.5μg/带。 G-250（蓝绿色），两步法：固定染色-脱色。 银染色。灵敏度为2ng/带。 固定-显色。实验繁杂，费用昂贵。 荧光染料染色。5ng/带，显色无背景干扰 。难保存电泳结果。 透析袋电洗脱收集蛋白样品，与其他技术联用进行分析。

33 4. 操作过程及注意事项 保存 凝胶照片保存。 凝胶保存。 含7%醋酸溶液的密封塑料袋保存2-3个月。 干燥保存。
凝胶厚度>1.0mm，用凝胶干燥仪干燥。 凝胶厚度<1.0mm，自然干燥。

34 小结 随着蛋白质组学，金属蛋白质组学等概念的提出，越来越多的科学家致力于研究活性蛋白与蛋白之间相互作用，膜蛋白复合物，蛋白质三维结构和功能分析，Native-PAGE由于其分离后仍能保持蛋白质的天然构象和功能的优势，必定会受到越来越广泛的应用。

35 谢谢大家!