第二节 细胞周期调控 一、MPF的发现及其作用

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1 第二节 细胞周期调控 一、MPF的发现及其作用
第二节 细胞周期调控 一、MPF的发现及其作用 MPF（卵细胞促成熟因子，matuation-promoting factor；细胞促分裂因子，mitosis-promoting factor；M期促进因子，M-phase-promoting factor）。 Johnson和 Rao(1970)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)。 G1期PCC为单线状，因DNA未复制；S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制；G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。

2 注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做MPF
人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：提示M期细胞存在诱导PCC的因子； 不同形态的PCC

3 不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)。 早在1960s，Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，后来Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子(MF)。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被统称为MPF。   年Maller实验室从非洲爪蟾卵中纯化出MPF，证明主要含p32和p45两种蛋白，表现出激酶活性。

4 二、P34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系
1960s L. Hartwell以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，CDC)，如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。 以P.Nurse为代表的另一批酵母生物学家研究不同温度下培养的裂殖酵母细胞，也分离出数十种温度敏感的突变体。这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为cdc(cell division cycle)基因，根据被发现的先后顺序被命名。

5 cdc2是第一个被分离出来的cdc基因，表达34kDa的蛋白，称p34cdc2。进一步研究发现其具有激酶活性，可以使许多蛋白磷酸化，在裂殖酵母的周期调控中起重要作用。芽殖酵母中的一个关键cdc基因是cdc28，是第二个被分离出来的cdc基因，编码34kDa的蛋白，具有激酶活性。 p34cdc28是 p34cdc2的同原物，调控细胞周期，特别是G2/M期转变。但研究者很快发现， p34cdc28 或p34cdc2单独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才具有活性（如p34cdc2和蛋白p56cdc13结合）。 之后，J.Maller和P.Nurse实验室立即合作，很快证明爪蟾卵中的p32与p34cdc2是同原物。与此同时，T.Hunt实验室等以海胆卵为材料研究细胞周期调控，发现一类与细胞分裂有关的蛋白，称为周期蛋白(cyclin)。然后J.Maller和T.Hunt实验室合作，发现周期蛋白B，证明与p45和p56cdc13为同原物。

6 2001年10月8日, L. Hartwell、P. Nurse、T. Hunt 因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖。

7 三、周期蛋白 自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎动物的A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合，不同的周期蛋白框识别不同的CDK,组成不同的周期蛋白复合体，表现不同的CDK激酶活性。 M期周期蛋白分子的近N端含有一段9个氨基酸组成的破坏框，参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解。G1期周期蛋白分子的C端含有一段特殊的PEST序列，可能与G1期周期蛋白的更新有关。

8 周期蛋白分子结构特征

9 不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。

10 四、CDK激酶和CDK激酶抑制物 在酵母cdc2和cdc28基因被分离后，几个实验室同时工作构建了人类、爪蟾和果蝇的cDNA文库，得到了一系列与cdc2相关的基因。他们有两个共同的特点，一是含有一段类似的氨基酸序列，二是都可以同周期蛋白结合。统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶，CDK激酶。 已经命名的CDK激酶包括：CDK1-8。cdc2最早被发现，被命名为CDK1。各种CDK分子都含有一段类似的CDK激酶结构域，其中一段PSTAIRE的序列相当保守，与周期蛋白的结合有关。另外，一些位点的磷酸化与激酶的活性有关。 CDK激酶的效应是多方面的，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。

11 与cdc2类似的CDK蛋白分子图解

12 细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDK inhibitor，CDKI）对细胞周期起负调控作用，目前发现的CDKI分为两大家族：
①Ink4(Inhibitor of cdk 4)，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6·cyclin D1复合物。 ②CIP/Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cip/waf1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，P21cip/waf1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）结合，直接抑制DNA的合成。

13 五、细胞周期转运调控 周期蛋白激酶

14 周期蛋白激酶的活性

15 细胞周期调控示意图

16 裂殖酵母细胞周期的调控

17 人细胞周期的调控

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19 （一）G2/M期转化与CDK1激酶的调控作用
CDK1激酶（p34cdc2激酶），由p34cdc2蛋白（或p34cdc28蛋白）与周期蛋白B组成。

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21 CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能。

22 细胞中CDK激酶的活性受到多种因素的调控

23 CDK1的激活需要Thr14和Tyr15的去磷酸化Tyr161的磷酸化
Weel1可以促进Thr14和Tyr15的磷酸化 Cdc25可以促进Thr14和Tyr15的去磷酸化

24 CDK1的调节与活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase

25 M-Cdk激酶的活性