实验四 球菌、杆菌.

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1 实验四 球菌、杆菌

2 实验内容 一，血浆凝固酶试验（球菌） 二，肥达试验（Widal Test）（杆菌）

3 Pyogenic coccus 奈瑟菌 葡萄球菌 链球菌

4 葡萄球菌 Staphylococcus

5 p. 106，《医学微生物学》，第二版，贾文祥主编，人民卫生出版社。

6 链球菌 Streptococcus

7 Streptococcus pneumoniae
肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae

8 溶血试验 hemolysis test Bacteria are grown on sheep blood agar plates (containing 5% sheep blood): α- hemolytic reaction, partial hemolysis with a green coloration： Streptococcus pneumoniae β- hemolytic reaction, complete hemolysis： Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes γ - hemolytic reaction, no hemolysis: Staphylococcus epidermidis most strains Staphylococcus saprophyticus

9 奈瑟菌 Neisseria

10 临床应用举例： 脓汁标本病原性球菌的分离鉴定
涂片、革兰染色、镜检 37℃ 24h 观察菌落特征 及溶血情况 血琼脂平板 生化反应、致病力试验及药敏试验

11 绿色不完全溶血环，为甲型溶血性链球菌或肺炎链球菌
G+、葡萄状排列； 菌落中等大小、不透明、金黄色； 完全溶血，可能是金黄色葡萄球菌; 可进一步做： 血浆凝固酶试验 甘露醇发酵试验 G+ 、链状； 菌落小、半透明； 完全溶血，为乙型溶血性链球菌。 G+ 、短链状； 绿色不完全溶血环，为甲型溶血性链球菌或肺炎链球菌 胆汁溶菌 菊糖发酵试验

12 若在中性粒细胞内外发现G-双球菌，可初步诊断为奈瑟菌：
若在脑脊液标本中发现，极有可能是脑膜炎奈瑟菌； 若在泌尿、生殖系统来源的标本中发现，极有可能是淋病奈瑟菌。

13 一，血浆凝固酶试验（操作） 一人一组

14 实验步骤（葡萄球菌血浆凝固酶试验） 取一个载玻片，划分3格，标记1、2、3。 在格内分别滴加： 以接种环挑取细菌混悬于液滴中：
1：兔血浆一滴 2：兔血浆一滴 3：盐水一滴 以接种环挑取细菌混悬于液滴中： 1：金黄色葡萄球菌 2：白色葡萄球菌 3：金黄色葡萄球菌 立即观察结果。

15 实验内容 一，血浆凝固酶试验（球菌） 二，肥达试验（Widal Test）（杆菌）

16 肠道杆菌 埃希菌属 沙门菌属 志贺菌属

17 somatic O Ag (lipopolysaccharide)
H Ag (flagella) K/Vi Ag (capsule) somatic O Ag (lipopolysaccharide)

18 二，肥达试验（Widal Test）（操作） 4人一组

19 肥达试验（Widal Test） 用已知伤寒沙门菌O、H抗原，以及甲型副伤寒、肖氏沙门菌、希氏沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清作定量凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。 用途：辅助诊断伤寒，副伤寒

20 熟悉肥达试验的 操作方法 结果观察 结果分析

21 肥达试验结果观察- 凝集反应的强弱标准 “++++” 液体清澈透明，菌体全部被凝成块，沉于管底
“+++” 液体较透明，大部分菌体被凝集而沉于管底 “++” 液体稍透明，管底有少量凝集沉淀物 “+” 液体较混浊，可见极少量凝集物 “-” 液体混浊，细菌因重力下降于管底呈边缘光滑圆点（与对照管相似）

22 肥达试验结果观察-血清效价 能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集）的血清最高稀释倍数，称为血清的效价。血清的效价代表着血清中抗体的含量，其效价愈高，所含抗体的量愈多。 如血清最低稀释倍数（1∶40）仍无凝集，则视为阴性或效价低于1∶40；如血清的最高稀释倍数（1∶1280）仍完全凝集，则示血清效价高于1∶1280。

23 实验步骤 取小试管32支，分成4排，每排8支，依次标号，并于小试管内各加入0.5ml生理盐水： 1-1、1-2、1-3、1-4……1-8
2-1、2-2、2-3、2-4……2-8 3-1、3-2、3-3、3-4……3-8 4-1、4-2、4-3、4-4……4-8 在每一排第1管中各加患者血清0.5ml，吸打混匀，吸取0.5ml 加入第2管稀释，从第2管吸取0.5ml加入第3管……依此作对倍稀释至第7管，弃去0.5ml。第8管不加血清作为空白对照。 2~4排按同法稀释。第8管均不加血清作为空白对照。 按8、7、6、5、4、3、2、1的顺序，分别加入抗原: 第1排各管:加入伤寒H抗原0.5ml 第2排各管:加入O抗原0.5ml 第3排各管:加甲型副伤寒(PA)H抗原0.5ml 第4排各管:加乙型副伤寒(PB)H抗原0.5ml 。 将各管混匀，置37℃水浴箱中16~18小时后观察结果。

24 粪便标本肠道杆菌的分离鉴定 克氏双糖铁 培养基 粪便 SS 平板 EMB平板 挑取可疑菌落 尿、靛、动 培养基 分析结果

25 生化反应 乳糖 葡萄糖 硫化氢 尿素 靛基质 动力 大肠杆菌 黄色 + - - + + 痢疾杆菌 红色 + - - +/- -
乳糖 葡萄糖 硫化氢 尿素 靛基质 动力 大肠杆菌 黄色 痢疾杆菌 红色 /- - 伤寒杆菌 红色 / 副伤寒杆菌 红色 变形杆菌 红色 /- + 糖发酵阳性，且产气 反应阳性

26 SS（stainless steel）平板－分离肠道病原菌的强选择培养基
成分和作用： 基础培养基：提供氮源和碳源 胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱 乳糖，中性红（pH ，红→橙黄） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质，菌落淡黄色；非致病菌分解乳糖产酸，菌落呈红色 病原菌:小,白色至淡黄色 非致病菌:大,红色

27 乳糖发酵 结果： - 白色菌落：致病菌 + 红色菌落：非致病菌 SS平板

28 EMB（Eosin Methyl Blue)平板－分离肠道病原菌的弱选择培养基
成分和作用： 基础培养基：提供氮源和碳源 伊红、美蓝：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱 乳糖：致病菌不分解乳糖，菌落无色半透明；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈紫黑色 病原菌:半透明,无色 非致病菌:紫黑色

29 克氏双糖铁（KIA）培养基 接种方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA深层，距管底3~5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵 育18~24h，观察结果 如何观察 观察上层含乳糖部分 乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌黄色 H2S 观察下层 发酵葡萄糖（产酸产气） 动力 乳糖 硫酸亚铁 固体 葡萄糖 半固体 指示剂:酚红

30 Urease test Principle: The hydrolysis of urea by urease produces ammonia and carbon dioxide. Ammonia alkalinizes the medium, and the pH is detected by the color change from light orange to pink-red. Medium: urea agar slant Indicator: phenol red Positive result: pink-red color Negative result: light orange

31 Indole （吲哚，即靛基质 ） test Medium: tryptone broth, a rich source of the amino acid tryptophan Indicator: Kovac‘s reagent (p-dimethylaminobenzaldehyde，对二甲基氨基苯甲醛) Principle: E. coli produce tryptophanase, an enzyme that cleaves tryptophan（色氨酸）, producing indole, which turn the color dark pink.