溫度對微藻去除氮磷及累積油脂之影響.

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1 溫度對微藻去除氮磷及累積油脂之影響

2 摘要 微藻生長時能攝取水中的氮磷合成細胞物質，並利用空氣中的二氧化碳生長，不需額外供給碳源，因此利用微藻去除水中的氮磷頗具發展潛力。另外，微藻為油質性族群之一，某些微藻族群具有在體內累積油質的特性，被廣泛研究用來生產生質柴油，作為可再生替代能源之來源。因此，本研究希望能結合微藻攝取水體中氮磷能力及累積脂質的特性，利用分離自中部水塘的Desmodesmus sp.TAI-1 及Chlamydomonas sp. TAI-2 各一株為試驗材料。

3 試驗結果顯示Chlamydomonas sp. TAI-2 於25℃時有最佳的生長速率0
試驗結果顯示Chlamydomonas sp. TAI-2 於25℃時有最佳的生長速率0.200 day-1，於各溫度下氮的利用率及脂質累積含量與生長有正相關的趨勢，磷的利用率則無明顯差異，而Chlamydomonas sp. TAI-2 於25℃下可100 %去除水體中之氮鹽，並可達最大脂質累積含量20.4%。Desmodesmus sp. TAI-1 則於30℃有最佳的生長速率0.210day-1，各溫度下氮磷的利用率與生長有正相關的趨勢，但脂質累積方面並無明顯差異，其平均脂質累積量為15.1%。 關鍵字：微藻、氮磷去除、油脂

4 一、前言 工業廢水排放為造成水污染的主要來源之一，其中高氮磷含量廢水會使水體發生優養化的現象，因此許多國家都制定相對應的排放標準，對氮磷實施嚴格的控制和管理，且在未來，環保法令對於管制的標準勢必日趨嚴峻。廢水中處理氮磷常見的方法有物化法和生物法，而生物技術之脫氮除磷程序兼具經濟、效率、可靠的優點，且不會造成二次污染，是目前普遍用來去除氮磷的技術(殷，2005)。 然而，由科學園區所排放出的低有機物含量之高氮磷濃度廢水，利用傳統的脫氮除磷程序需額外添加有機物作為脫氮、除磷菌所需的碳源，相對地提高廢水的處理成本。

5 而光合自營性藻類可直接以空氣中的CO2 作為碳源，藉由微藻合成細胞達到去除水中氮磷的效果，並可透過生長時水體中pH 的升高促進廢水中氨氮的逸散及磷酸鹽的沉澱，同時藉由生物及物化機制來達到去除水中氮磷的效果(Carlsson et al.1997,Martinez,2000)。另一方面，由於石化能源匱乏及環境污染的問題日益加劇，近年來藻類亦在生產生質柴油方面被大量的研究，期望做為一項乾淨的替代能源之一，根據研究顯示，某些微藻透過培養條件的控制，最高甚至可累積油脂含量達藻體乾重的70 %以上，與其他油源作物相較下，微藻在生長方面有較短的生長週期、較高的比生長速率、單位面積產量是高等植物的數倍…

6 等的優勢，因此微藻在生質能源的發展上極具潛力(Chisti,2007；Guanhua,2010)。
若在解決環境問題的同時又能回收能源，解決人類面臨的能源問題，便能達到一 舉兩得的功效，使藻類在環境應用上有更高的效益。 本研究將利用由中部水塘分離的Chlamydomonas sp. TAI-2 及Desmodesmus sp. TAI-1 各一株，由培養基進行批次試驗瞭解此兩株微藻最佳生長溫度，再進一 步利用工業廢水進行測試，以探討其對工業廢水氮磷的去除效率，並觀察兩藻株 脂質累積的情形。

7 二、材料與方法 1. 試驗材料 由台灣中部水塘所分離之Desmodesmus sp. TAI-1 及Chlamydomonas sp.TAI-2 為試驗材料，使用之培養基為Modified by Bold’s basal medium (BBMmedium) (Stein,1973)。。 2. 反應槽設置 本實驗反應槽架設如圖1 所示，反應槽提供之光照強度為120 E/m2s，於試程中進行24 小時光照，利用加熱器及冷凝器控制水浴槽溫度以維持試程中所需之溫度條件，可藉由電子流量計調控不同CO2 進氣濃度，進氣前會經過gas filter(Pall Corporation, 0.2m)濾除空氣中的顆粒及菌體，以確保系統之純藻培養，管型反應器之工作體積為300 ml，曝氣量為50 ml/min。

8 圖1 反應槽圖示

9 水質分析方法 (1) O.D.及pH 藻液以分光光度計( HITACHI SPECTROPHOTOMETER, U2800 )測量其細胞濃度，選定波長為680 nm；pH 以pH meter ( WTW inoLab pH/ION LEVEL2 )量測。 (2) COD 方法參見Standard method 508C(Greenberg et al.,1985)。將水樣與重鉻酸鉀消化溶液及硫酸試劑加熱消化，待冷卻至室溫後以分光光度計測其吸光度(660 nm)進行比色分析。 (3) 硝酸鹽氮分析方法 將水樣以0.2 m 濾頭過濾後，以離子層析儀( HITACHI,管柱Shodex IC ,NI-424 )分析水樣中之硝酸鹽氮濃度。

10 (4) 氨氮分析方法 (環檢所標準方法 NIEA W448.51B)
將水樣加入次氯酸鹽（Hypochlorite）及酚溶液反應，生成深藍色之靛酚 （Indophenol），此溶液之顏色於亞硝醯鐵氰化鈉溶液（Sodium nitroprusside）之催化後會更加強烈。使用分光光度計於波長 640 nm 進行比色分析，並依照檢量線求得水樣中氨氮之濃度。 (5) 正磷酸鹽分析方法 (環檢所標準方法 NIEA W427.52B) 水樣經0.2μm 過濾頭過濾後，加入鉬酸銨、酒石酸銻鉀，使其與正磷酸鹽作用生成一雜多酸－磷鉬酸(phosphomolybdic acid)，經維生素丙還原為藍色複合物 鉬藍(molybdenum blue)，以分光光度計於波長880 nm 測其吸光度定量之。

11 (6) 藻細胞總脂質萃取方法(Modify of Bligh and Dyer)(賴，2008)
將離心收集的藻細胞冷凍乾燥，秤重後加入methanol/chloroform 為 1：2 (v/v)之混合液，以超音波震盪器震盪萃取，經90 分鐘萃取後離心收集萃取液，共經三次萃取。合併三次萃取液置入40℃水浴使萃取之有機溶劑揮發，待乾燥後測其衡重得總脂質含量。總脂質占細胞乾重含量以下列公式計算： 總脂質含量百分比 = ( 總脂質重 / 藻體乾重 ) × 100 % (7) 脂肪酸分析方法 將萃取所得總脂質進行轉脂化反應後，利用氣相層析儀(Gas ChromatographyHP6890,USA)分析藻體中脂肪酸分布情形(賴，2008)。

12 三、結果與討論 1. 溫度對微藻生長及攝取氮磷的影響
Chlamydomonas sp. TAI-2 和Desmodesmus sp. TAI-1 在控制pH 之培養基中，探討不同溫度下的生長以及氮磷營養鹽的去除情形。在批次試驗溫度條件為21、25、30、35℃的狀況下，Chlamydomonas sp. TAI-2 的比生長速率分別為0.18、0.2、0.15、0.14 day-1，由圖2(a)的結果顯示，Chlamydomonas sp. TAI-2在25℃條件下有較佳的生長情形，並在試程的終點達到較多的biomass 產量，但與其他試驗溫度相比較之下，Chlamydomonas sp. TAI-2 在21-35℃範圍內的生長情形並無太大的差異，顯示Chlamydomonas sp. TAI-2 在此溫度範圍內皆能穩定生長。

13 而在營養鹽的利用方面，Chlamydomonas sp
而在營養鹽的利用方面，Chlamydomonas sp. TAI-2 在不同溫度條件下利用培養基中氮、磷營養鹽生長的情形如圖2(c)、(d)所示，培養基中以硝酸鹽氮做為微藻生長的氮源，初始濃度約為44 mg/L，磷酸鹽濃度約為55 mg/L，在25℃之條件下，Chlamydomonas sp. TAI-2 於試程的6-8 天之間即可100 % 去除水中的硝酸鹽氮，而在21、30 及35℃的條件下，則分別在試程的終點，即第12 天達到100 %、79.8 % 及73.1 % 的去除率，根據實驗結果顯示，Chlamydomonassp. TAI-2 對於培養基中氮的攝取量和其生長情形有正相關的趨勢；然而，Chlamydomonas sp. TAI-2 在21、25、30、35℃條件下去除磷酸鹽的情形則無太大的差異，分別為29 %、32.1 %、31.7 %及31.1 %。

14 Desmodesmus sp. TAI-1 在試驗溫度條件為25、30、35℃的狀況下，比生長速率分別為0. 19，0. 21，0
Desmodesmus sp. TAI-1 在試驗溫度條件為25、30、35℃的狀況下，比生長速率分別為0.19，0.21，0.14 day-1，由圖3(a)的結果顯示，其在30℃下有較佳的生長情形，相較於25℃及35℃，Desmodesmus sp. TAI-1 在35℃後期生長有明顯的遲滯現象，並且觀察到反應槽中的藻體顏色在後期有明顯變黃的現象，因此推測在此溫度條件下不利於Desmodesmus sp. TAI-1 生長，亦可能為溫度導致氣體溶解度下降造成Desmodesmus sp. TAI-1 後期生長的遲滯，由此現象可知，其較能適應的溫度範圍約為25-30℃之間。

15 而Desmodesmus sp. TAI-1 利用氮磷營養鹽的情形如圖3(c)與(d)所示，在25℃及30℃達到相近的硝酸鹽氮去除率分別為69.3%及72.5 %，而在生長狀況不佳的35℃僅達到46.7 %的去除率。在磷的攝取方面，Desmodesmus sp. TAI-1 在25、30、35℃的條件下分別僅有19 %，18 % 及11.7 %。

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18 在不同溫度條件下藻體累積脂質的含量如圖4 所示，Chlamydomonas sp. TAI-2 在25℃時有最大的脂質累積含量20
在不同溫度條件下藻體累積脂質的含量如圖4 所示，Chlamydomonas sp.TAI-2 在25℃時有最大的脂質累積含量20.4 %，在21℃時為17.7%，在30 及35℃時分別為17.7 %及15.1 %；而Desmodesmus sp. TAI-1 在試驗溫度25-35℃的範圍內，其藻體內脂質的累積含量並無太大的差異，約為15.1 %。在過去的研究中，有學者針對某些藻種進行溫度對總脂質含量變化的影響，其趨勢並不一致，根據Converti 等學者之研究(2009)，C. vulgaris 在培養溫度由30℃下降到25℃時，總脂質含量由5.9 %上升到14.7 %；另外，Renaud 等學者曾比較包括Chaetoceros sp.、Rhodomonas sp.、Cryptomonas sp.及一種未確認之藻種(prymnesiophyte)等四種藻屬在不同培養溫度下的生長變化，研究結果亦顯示，不同的藻種在最大脂質含量下的最適溫度也不盡相同，其中，Chaetoceros sp.的最適溫度為35℃，其餘三種藻類的最適溫度範圍則在27 ~ 30℃，且最佳脂質累積的生長溫度下未必有最大的生長速率。

19 而本試驗之結果與上述之現象相符，生長溫度對藻體累積脂質含量的影響因藻種而異，沒有一定變化的趨勢。根據實驗結果可知，Chlamydomonas sp. TAI-2 在25℃下的脂質累積量達最大量，正好與最佳生長溫度相符，顯示Chlamydomonas sp. TAI-2 累積脂質的能力與生長當時的活性有關，並在適合的生長溫度條件下可同時可獲得最大的biomass 及脂質累積量，增加了未來在實際應用的便利性；另外，Chlamydomonas sp. TAI-2 在25℃試驗條件下，試程結束時藻株正處於缺氮狀態，而多數的研究提出微藻在缺氮的條件下可達到較高的脂質累積含量，因此Chlamydomonas sp. TAI-2 脂質累積含量增加的情形可能同時受到溫度及水體中氮源濃度的影響(Illman,2000)。

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21 綜合以上兩株微藻在不同溫度下生長、營養鹽去除及體內脂質累積含量的結果，兩株微藻對於培養基中氮源的去除率皆與生長有正相關的關係，也證明了藻株需要合適的生長溫度環境以增加對水體中氮源的攝取量，溫度太高或太低都可能抑制微藻對水體中氮源的攝取，進而影響到生長所需的蛋白質合成；另外，Chlamydomonas sp. TAI-2 在不同溫度下對於培養基中磷的攝取量幾乎沒有差異，一方面是由於藻細胞對磷的需求量遠小於對氮的需求量，因此，因為生長情

22 形而導致氮攝取量的差異較為顯著，對於磷在水體中濃度的變化並不明顯。而Desmodesmus sp
形而導致氮攝取量的差異較為顯著，對於磷在水體中濃度的變化並不明顯。而Desmodesmus sp. TAI-1 在35℃的條件下明顯不利於生長，因此對於水體中磷的利用有較顯著的下降趨勢。 由此批次試驗結果顯示，當初始O.D.皆為0.2，Chlamydomonas sp. TAI-2在最佳溫度條件25℃下，無論是去除水中氮、磷的效果，或是體內脂質的累積含量，相較於Desmodesmus sp. TAI-1 之組別都有較佳的情形，且Chlamydomonassp. TAI-2 所能適應的溫度範圍較大，因此，在實際應用上Chlamydomonas sp.TAI-2 較具有發展潛勢，比較結果如表1 所示。

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24 2. 微藻利用廢水之初步實驗測試 初步實驗之廢水為一有機物質含量低之工業廢水，COD 為16 mg/L。控制初步實驗試程溫度為30℃，曝氣條件為曝氣流量50 ml/min 之空氣(約0.03% CO2)。兩株微藻的生長情況如圖5(a)所示，Chlamydomonas sp. TAI-2 的初始O.D.由0.198 增長至1.167，Desmodesmus sp. TAI-1 的初始O.D.由0.208 增長至0.934，由實驗結果顯示兩株微藻皆能利用培養基做為生長基質，且Chlamydomonas sp.TAI-2 較Desmodesmus sp. TAI-1 有較好的生長情形。

25 圖5(c)與(e)之結果顯示，未添加藻類之空白組其氨氮濃度與初始濃度相近，代表廢水中氨氮的去除主要是被藻類吸收所利用。廢水中氨氮初始濃度為26.9mg/L，Chlamydomonas sp. TAI-2 在試程開始6-8 天後即可對氨氮達到100 %的去除，接著在8-10 天之間利用完水中的硝酸鹽氮；Desmodesmus sp. TAI-1 則在8-10天之間對氨氮有100 %去除，接著在12-14 天之間利用完水中的硝酸鹽氮。

26 由此結果可以得知，此兩株藻對氮鹽的利用皆是先利用氨氮再利用硝酸鹽氮，且Chlamydomonas sp
由此結果可以得知，此兩株藻對氮鹽的利用皆是先利用氨氮再利用硝酸鹽氮，且Chlamydomonas sp. TAI-2 比Desmodesmus sp. TAI-1 有較快的利用速率。在磷酸鹽利用方面，根據圖5(d)之結果可知，在添加藻株的實驗組別中，磷酸鹽濃度皆有下降較快的趨勢，Chlamydomonas sp. TAI-2 在6-8 天之間即可對磷酸鹽達到100%去除；相較於Chlamydomonas sp. TAI-2 對磷酸鹽的去除情形，Desmodesmussp. TAI-1 對磷酸鹽的去除則呈現不穩定的情況，試程開始後0-4 天磷酸鹽濃度由36.10 mg/L 下降至10.36 mg/L，在6-10 天之間磷酸鹽的濃度卻有些微上升，並於12-14 天又急遽下降，推測造成此結果之原因和系統中pH 的變化有關，在Martínez 等學者的研究顯示氨氮去除會造成系統中pH 下降，如下列化學反應式 所示：NH4+ → NH3 + H+ → org-N + H+ (Martínez et al.,2000)

27 當系統中pH 低於6 以下時可能會超出Desmodesmus sp. TAI-1 所能生存的pH 範圍，造成部分Desmodesmus sp
當系統中pH 低於6 以下時可能會超出Desmodesmus sp. TAI-1 所能生存的pH 範圍，造成部分Desmodesmus sp. TAI-1 細胞死亡，磷以正磷酸鹽的形式釋放至水體中造成磷酸鹽濃度上升，當pH 再度回復到6 以上，有活性的Desmodesmussp. TAI-1 會繼續利用廢水中的磷酸鹽生長，在35℃的廢水試驗中也觀察到因為pH 變動所造成的釋磷情形(結果未列出)。根據圖5(d)的結果顯示，空白組磷酸鹽濃度亦有下降的情形，推測原因可能與廢水中的磷酸鹽產生沉澱現象有關，在實驗過程中可於空白組別中觀察到白色的細小懸浮顆粒。根據初步試驗的結果，O.D.的上升代表兩株微藻皆可利用廢水做為基質進行細胞分裂，並且攝取培養基中的氮、磷源做為所需的生長物質，試驗結果也指出Desmodesmus sp. TAI-1 不適合在pH 小於6 以下的條件生存。

28 圖5. 初步測試微藻在工業廢水中之生長情形、氮磷利用情形及試驗過程pH 之 變動( ■：Chlamydomonas sp
圖5. 初步測試微藻在工業廢水中之生長情形、氮磷利用情形及試驗過程pH 之 變動( ■：Chlamydomonas sp. TAI-2；●：Desmodesmus sp. TAI-1；▲：blank )

29 四、結論 1. Chlamydomonas sp. TAI-2 於21、25、30 及35℃的培養條件下，於25℃時有最佳的生長速率，氮鹽的利用率及脂質累積含量與各溫度下之生長情形有正相關的趨勢，磷的利用情形則在不同生長溫度下則無明顯差異，Chlamydomonas sp.TAI-2 於25℃可100%去除水體中的氮鹽，最佳脂質累積含量20.4 %；2. Desmodesmus sp. TAI-1 在溫度區間為25、30 及35℃的條件下，於30℃有最佳的生長情形，氮磷的利用率與生長有正相關的情形，但脂質累積方面並無明顯差異，Desmodesmus sp. TAI-1 於30℃可去除水體中72.9 %之氮鹽，各溫度下脂質平均累積量為15.1%。3. 經由初步測試結果顯示，兩藻株皆有利用工業廢水做為生長基質的能力，Chlamydomonas sp. TAI-2 可於培養第6 天將氨氮消耗完畢，接著硝酸氨氮開始被利用直至第10 天消耗完畢。Desmodesmus sp. TAI-1 可於培養第10 天將氨氮消耗完畢，接著硝酸氨氮開始被利用直至第14 天消耗完畢。兩株綠藻均可於第8 天將磷消耗完畢。

30 五、誌謝 本研究承國科會大專生參予研究計畫 ( C E) 之經費補助，在此致由衷之謝忱。

31 六、文獻參考 1. 殷伊嫻，“固定化藍綠細菌在氣舉式流體化床處理含氮廢水之研究”， 碩士論文，國立中興大學環境工程學研究所，台中市(2005)。 2. Carlsson, H., H. Aspegren, and N. Lee, “Calcium phosphate precipitation inbiological phosphrous removal system,” Water research, Vol.31, No.5, pp (1997). 3. Martinez, M.E., S. Sanchez, J.M. Jimenez, F. El Yousfi, and L. Munoz, “Nitrogenand phosphorus removal from urban wastewater by the microalga Scenedesmusobliquus,” Bioresource Technology, Vol.73, No.3, pp (2000). 4. Chisti, Y, “Biodisel from microalgae,” Biotechnology advances, Vol.25, No.3, pp (2007). 5. Guanhua, H., F. Chen, D. Wei, X.W. Zhang, and G. Chen, “Biodiesel productionby microalgal biotechnology,” Applied Energy, Vol.87, No.1, pp (2010).

32 6. Stein, J. R. ,. Handbook of Phycological methods
6. Stein, J.R.,.Handbook of Phycological methods. Culture methods and growthmeasurements. Cambridge University Press,pp. 448(1973). 7. Greenberg, A., R.R. Trussel, L.S. Cleseeri.Standard Methods for the Examinationof Waste and Wastewater,16thed., Am. Public Health Assoc., Washington,pp.1268(1985). 8. 賴芃劭，“高脂質累積潛力微藻脂分離及生質柴油生長限制因子之探討”，碩士論文，國立中興大學環境工程學研究所，台中市(2008)。 9. Converti, A., A.A. Casazza, E.Y. Ortiz, P. Perego, and M.D. Borghi,“Effect oftemperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content ofNannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodieselproduction,”Chemical Engineering and Processing, Vol.48, No.6, pp (2009). 10. Renaud, S.M., L.V. Thinh, G. Lambrinidis, and D.L. Parry,“Effect of temperature ongrowth, chemical composition and fatty acid composition of tropical Australianmicroalgae grown in batch cultures,”Aquaculture, Vol.211, No.1-4, pp (2002). 11. Illman, A.M., A.H. Scragg, and S.W. Shales,“Increase Chlorella strains calorificvalues when grown in low nitrogen medium,”Enzyme Microbial Technology,Vol.27, No.8 pp (2000).