第七章 蛋白质的分离、纯化和表征.

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1 第七章 蛋白质的分离、纯化和表征

2 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质是两性电解质 可解离基团：-氨基， -羧基，侧链R基团
蛋白质等电点：在某一pH值，蛋白所带正负电荷相等，即净电荷为零时溶液的pH称为该蛋白等电点。

3 二、蛋白质分子大小与形状 （一）根据化学组成测定最低分子量
例：肌红蛋白含铁量为0.335%，其最小分子量是多少？血红蛋白含铁量也是0.335%。试求其分子量。 解：肌红蛋白的分子量为： 100：0.335=M：56 M=100*56/0.335= 血红蛋白的分子量为： 100：0.335=M：（456） M=

4 （二）几种测定蛋白分子量方法 1、渗透压法：=cRT/Mr 2、测定扩散系数法:随Mr增加而降低 3、沉降法 *4、凝胶过滤法
规定10-13秒为一个单位，称为沉降系数单位，用S表示。 *4、凝胶过滤法 **5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法

5 凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法测定蛋白质分子量
测定蛋白分子量 测定蛋白 标准蛋白 logMr=K1-K2R

6 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 1、蛋白质溶液是一种胶体溶液； 水化作用，双电层结构 2、蛋白质沉淀 （1）盐析：加入中性盐，破坏蛋白水化层引起沉淀 （2）有机溶剂沉淀：加入极性有机溶剂，脱水化层，破坏双电层 （3）重金属盐沉淀：结合成不溶性盐 （4）加热变性

7 四、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择好的材料 2、前处理：匀浆或捣碎等 3、粗分离：盐析，有机溶剂沉等 4、细分离：凝胶过滤，离子交换等
蛋白质分离纯化的几个基本原则 四、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择好的材料 2、前处理：匀浆或捣碎等 3、粗分离：盐析，有机溶剂沉等 4、细分离：凝胶过滤，离子交换等

8 五、蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同： 1、透析：利用蛋白质分子不能透过半透膜，使蛋白质和其他小分子分开。 2、凝胶过滤：利用蛋白质分子大小不同将蛋白分开。

9 分子筛层析的工作原理 凝胶过滤的工作原理 也叫分子筛层析

10 （二）根据溶解度差别： 1、等电点沉淀法：等电点时蛋白质溶解度最低，不同蛋白具有不同等电点。 2、盐析法 3、有机溶剂法

11 （三）根据电荷不同： *离子交换层析 原理

12 离子交换层析的洗脱 离子交换层析的洗脱过程示意

13 蛋白质分离纯化的其它方法 1、亲和层析 2、疏水作用层析 3、金属螯合层析：Ni2+-柱

14 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色
蛋白质的定量法 蛋白质的定量法 凯氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可

15 习题 盐析作用 疏水相互作用 透析 *分离纯化蛋白质主要根据蛋白质的哪些性质 A 分子的形状和大小 B 粘度不同
盐析作用 疏水相互作用 透析 *分离纯化蛋白质主要根据蛋白质的哪些性质 A 分子的形状和大小 B 粘度不同 C 溶解度不同 D 溶液的pH值 E 电荷不同 *蛋白质胶体溶液的稳定因素是： A 蛋白质颗粒在溶液中进行布朗运动，促使其扩散 B 蛋白质分子表面有水膜 C 蛋白质溶液粒度大 D 蛋白质分子带有同性电荷 凝胶过滤法测定蛋白质分子量是根据不同蛋白质带电荷多少进行的。 用透析法可解开蛋白质中的二硫键。 SDS-PAGE测定蛋白质分子量的方法是根据蛋白质分子所带电荷不同。

16 习题 在水溶液中，蛋白质溶解度最小时的pH值通常就是它的等电点。 已知牛血清白蛋白含色氨酸0.58%(按重量算),色氨酸分子量为204。
(1)计算最低分子量； (2)用凝胶过滤测得牛血清白蛋白分子量大约为7万,问该分子中含有几个Trp残基。 一种酶分子量为360,000, 在酸性环境中可解离为二个不同成分, 其中一个成分分子量为120,000, 另一个为60,000. 大的占总蛋白的三分之二, 具有催化活性; 小的无活性. 用β-巯基乙醇处理时, 大的颗粒即失去催化活性, 并且它的沉降系数减小, 但沉降图案上只呈现一个峰. 关于该酶的结构可做出什么结论?

17 在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下：
蛋白 相对分子量 等电点 A B C 试设计一个方案分离纯化这三种蛋白质。 请分别阐述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析分离蛋白质的原理，并比较这两种方法分离蛋白质的异同点。

18 请分别阐述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析分离蛋白质的原理，并比较这两种方法分离蛋白质的异同点。