第四节 原位杂交 核酸原位杂交技术就是利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。 原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、寡

Presentation on theme: "第四节 原位杂交 核酸原位杂交技术就是利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。 原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、寡"— Presentation transcript:

1 第四节 原位杂交 核酸原位杂交技术就是利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。 原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。

2 原位杂交的基本原理 当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双链分子会变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或PH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺序同源互补或者部分同源互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性，产生分子杂交。

3 原位杂交技术包括有：菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）、组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）和基因组原位杂交（Genome in situ hybridization) 原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。

4 原位杂交技术主要步骤： 材料处理及细胞样品的固定； 样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性； 杂交温育；
检测杂交信号，进行结果分析。

5 染色体制片技术发展 染色体制片主要包括三类：一是中期染色体制片，二是粗线期染色体制片，然后是DNA纤维制片 。
中期染色体具有良好的形态结构，容易辨认，分辨率低，仅能达到1~3Mb，可检测到的DNA序列间长度一般要求超过1Mb。 粗线期的染色体的线性长度约为中期染色体的5~30倍，分辨率可达100kb，可识别的DNA片段长度大于100kb 。 DNA纤维制备技术所产生的染色体纤维的分辨率接近游离态DNA双螺旋，实际实验中可以达到几个kb。

6 玻片的处理 原位杂交程序繁杂而且周期长 ，DNA更需要在玻片上表现出强有力的粘附性。
常用的粘附剂有铬矾-明胶液、多聚赖氨酸溶液 、Vectorband Reagent粘附剂 、Tricholosilane（分子式为SiCl3-(CH2)6-CH=CH2 ） 、3-氨丙基三乙氧基硅烷 （3-Aminopropyl- triethoxysilane, APES ）

7 探针制备技术 探针的制备主要采用缺刻平移法、随机引物法或者PCR扩增合成，对同位素标记探针的方法还经常用到末端标记法。
而探针的标记物分为同位素标记和非同位素标记两大类，前者标记物一般为3H 、35S或32P；，后者有生物素或地高辛的间接标记或者利用FITC或者罗丹明对探针分子进行直接标记。

8 探针标记方法 放射性标记有体内标记法及体外标记法 。
体外标记法不需要活体生物，所得探针放射性较高。故一般用体外标记法。体外标记法有两种：化学法和酶法。 化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应而进行标记，标记物直接与核酸分子相连。 酶法是先将标记物标记在核苷酸上，然后再通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生核酸探针。常用的有切口平移法、随机引物法、未端标记法。

9 切口平移法 原理：DNA酶I在Mg2+离子存在时，能在双链DNA的各股单链的不同位置上造成随机切口，然后在存在着一种已标记DNTP底物（如Dig-dUTP）的体系中用大肠杆菌聚合酶I（pol I）进行5’→3’修复合成，在这个反应过程中将已标记的DNTP合成进DNA链中。

10 该方法使用时应注意： 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。
A.只能标记双链DNA，使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小； B. DNA酶I使用的量要合适，太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口； C. 标记时间不能太短，太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行。

11 随机引物合成法 用一些随机引物和探针DNA片段一起加热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在大肠杆菌聚合酶I的作用下，按碱基互补配对的原则不断在其3’端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的探针片段。

12 随机引物法是近几年来兴起的一种有效的标记方法，可与PCR技术方法结合进行引物的标记。此法对于较小的DNA片段也能很好地进行标记，一般对基因组DNA进行标记时用这种方法的效果较好。
除此之外，该方法有如下一些优点： A.模板的纯度不是很高也可以进行标记； B.反应比较稳定，可通过延长反应时间来增加探针产量； C.标记的探针活性高，易于杂交的检测； D.该方法可以在低熔点琼糖中进行，易于回收探针。

13 末端标记法 生物素光照法 该标记方法标记的是线性DNA或RNA的5’端或3’端。
  末端标记法 该标记方法标记的是线性DNA或RNA的5’端或3’端。 5’端标记时，先用碱性磷酸酶切除5’端的磷酸基团，然后用T4多聚核苷酸激酶催化标记的ATP连接到DNA片段5’端，从而使DNA片段成为标记探针； 3’端标记时，用未端转移酶催化已标记的DNTP加到寡核苷酸的3’端，成为标记探针； 未端标记法常用来进行各种放射性探针的标记。 生物素光照法 光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学反应，与核酸形成牢固的共价结构，再借助于酶的显色反应，即可显示杂交的位置。

14 原位杂交的基本步骤 1.制片 染色体原位杂交要求高质量的细胞学制片，因而需要最好的细胞分裂相。
细胞分裂相应尽可能干净，没有细胞壁和细胞质的干扰。 用RNA酶除去细胞质中的RNA，避免其与探针DNA杂交。 用蛋白酶K酶解以增大材料的渗透性并除去与DNA粘连且抑制探针杂交的蛋白 。

15 2.杂交液的配制 杂交液所含成分除大约2.5 ng/ul的标记探针DNA外，还包括：
0.1SDS,它有助于探针的渗透; 2×SSC,作为调节探针洗脱强度的缓冲液; 封阻DNA：浓度通常为探针DNA的1～100倍,作用是杂交掉探针中的相似序列，阻止探针DNA与非目标DNA的粘连，即用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。

16 3.变性及杂交 制片DNA一般用70%去离子甲酰胺于70%下变性2分钟即可。 杂交探针需于70-90℃ 下变性10分钟。
注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。 杂交一般是在探针温度大约在Tm-25℃ （基因组原位杂交一般是37℃）、避光恒温条件下进行，持续时间可以是12-20小时，在此期间，要注意保湿。

17 4.洗脱 洗脱的目的是去掉杂交弱的探针,减少杂交背景,有利于信号的检测。一般用2×SSC洗3次,每次5～10min, 其中第1和第2次用42℃,第3次用室温洗。在第2次洗的2×SSC中含有50%甲酰胺。 原位杂交实验最初的洗脱强度应该低一些，有助于探针与目标DNA形成专一性结合。增大洗脱强度可以除去非专一性杂交阻止部分或全部交叉杂交的作用，减少杂交背景，但可能会减少信号的强度。

18 5.检测 （1）    利用酶催化显色反应识别 （2）    荧光显微镜观察杂交信号 基因组原位杂交大小麦杂交后代中大麦遗传物质的鉴定

19 以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布

20 原位杂交技术在遗传学研究中的应用 中期及间期细胞遗传学分析 染色体结构变异鉴定 检测基因扩增和缺失 基因或者特异性DNA序列的定位
染色体RNA和基因组进化的研究

21 附：染色体核型模式照片和核型图

22 附：减数分裂花粉母细胞染色体配对情况

23 附：染色体分带结果