SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳.

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1 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

2 主要内容 实验目的 实验原理 实验材料和试剂 实验步骤 结果处理

3 实验目的 了解电泳实验原理 掌握电泳实验操作规程 用电泳方法测定蛋白分子量

4 实验原理 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

5 SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。

6 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

7 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：
丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）  15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。

8 实验材料和试剂 试剂 丙烯酰胺和N, N’-亚甲双丙烯酰胺 十二烷基硫酸钠（SDS） 用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液
TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 样品处理液（50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油） 染色液（0.1% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇10% 冰醋酸） 脱色液（10% 甲醇，10% 冰醋酸）

9 实验步骤 1.配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试 2.SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液； 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水； 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

10 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。 浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶）。 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

11 3.用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色
经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色1～2小时或过夜。 4.换脱色液脱色，需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。 此方法检测灵敏度为0.2～1.0 mg。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。

12 结果处理 测量并计算分子量 蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式 Mw ＝ K(10－bm) (1)
lgMw = lgK－bm = K1－bm (2) 其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数 b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。 mR=dpr/dBPB