分子生物学实验 PCR扩增目的基因.

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1 分子生物学实验 PCR扩增目的基因

2 实验目的 (1)PCR扩增目的基因红细胞生成因子nap基因 部分片段； (2)掌握PCR扩增原理； (3)学习并熟悉PCR操作

3 实验原理 (1)PCR反应原理

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7 循环1 循环2 循环3 温度（℃） 时间（min） 94℃变性（1min） 94 72 60 72 ℃延伸（1.5min）
循环 循环 循环3 温度（℃） 94℃变性（1min） 94 72 60 72 ℃延伸（1.5min） 60 ℃退火（1min） 时间（min）

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10 (2)PCR反应体系 总体系一般采用25或50ul 模板核酸 （ template如：人基因组DNA 0.1ug)
扩增引物 （primer一对,各0.25umol/L） TaqDNA聚合酶（2.5U） dNTP （四种：各200umol/L) 标准的缓冲液 X buffer（KCl、Tris-HCl、 MgCl2、BSA或明胶） 无菌双蒸水或三蒸水 石蜡油或矿物油 30~50ul（封闭、防止高温时液体的 挥发）

11 实验步骤 (1)配制PCR反应体系 25 μl 10X PCR Buffer 2.5 dNTP 2 Primer F 1
Primer R Template Taq H

12 (2)设置PCR反应条件 95 ℃ 5min 94 ℃ sec 55 ℃ sec 72 ℃ sec 72 ℃ 5min 33cycles

13 实验结果 琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应结果，在500bp 左右有明显扩增条带。

14 实验二 质粒DNA的碱法小量制备

15 实验目的   学习利用碱法小量制备质粒

16 实验原理 (一) 细菌培养物的生长 (二) 细菌的收获和裂解
从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒。 (二) 细菌的收获和裂解 (1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

17 (2)可用更剧烈的方法来分离小质粒 在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

18 实验步骤 (一) 细菌的收获和裂解 1. 收获 (1)将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。 (2) 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。 (3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

19 2. 碱裂解法 (1)将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。 溶液Ｉ 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。

20 (2) 加200μl新配制的溶液Ⅱ。 溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1%SDS 盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。 (3) 加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ 溶液Ⅲ 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。 盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上３－５分钟。

21 (4) 用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
(6) 用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合, 于室温放置2分钟。 (7) 用微量离心机于4℃以12 000g离心５分钟。 (8) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

22 实验结果与讨论 质粒制备后，实验结果要通过普通琼脂糖凝胶电泳来分析。由于一般质粒提取后可能存在的超螺旋、线状和开环三种形态，使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。 常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

23 细胞生物学实验 密度梯度离心法提取叶绿体

24 一、实验原理 用低温研磨的方法将植物组织、细胞破碎，细胞内不同的组分游离在酸碱度和渗透压与亲体状态下均接近的匀浆介质中。将上述含细胞不同组分的匀浆介质加入到预先铺制好的蔗糖密度梯度介质中，低温高速离心后，在离心力的作用下，沉降系数不同的组分，就会出现在离心管内不同的位置，达到分离、制备的目的。

25 二、目的和要求 通过此试验，使学生学习密度梯度离心法提取植物叶绿体的技术，巩固掌握非染色法观察细胞器的方法。

26 三、实验材料和仪器 新鲜菠菜叶子 组织捣碎器、普通离心机、高速冷冻离心机、离心管、烧杯、漏斗、纱布、载玻片、盖玻片、显微镜、剪刀、滴管。

27 四、药品及试剂配制 蔗糖、三羟甲基甲胺（Tris）、HCl。
匀浆介质（0.5M蔗糖、0.05M Tris-HCl缓冲液PH7.4）：称 85.55克蔗糖、6.05克Tris，溶解在近800毫升蒸馏水中，加入4.25毫升0.2NHCl，加蒸馏水到100毫升。

28 五、实验步骤 1.洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5克，剪碎。 2.加入预冷到接近0℃的匀浆介质20毫升，高速捣碎2分钟。
3.用双层纱布过滤。 4.滤液500rpm离心5分钟，去沉淀。

29 5.在离心管内依次加入50%、15%蔗糖溶液制成梯度。
6.在梯度液面上轻轻加入样品。 rpm,低温离心20分钟。 8.叶绿体在梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察叶绿体的形态。

30 六、注意事项 1、配制匀浆介质和离心介质时要准确。过高或过低的酸碱度和渗透压可能造成细胞内组分的裂解。
2、各实验步骤中要尽量在低温下进行，高温同样造成细胞内组分的裂解。 3、蔗糖密度梯度铺制时要小心，防止因用力过猛使上、下层离心介质混合，影响实验结果。

31 七、作业 1.绘制你看到的叶绿体形态。 2.你分离的叶绿体是否纯净？试分析原因。

32 生物化学实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

33 一、实验目的 了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的操作步骤

34 二、实验原理 根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的蛋白质常用分析方法。 考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。

35 Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。据估计比Lowry法约高四倍，
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

36 三、仪器和试剂 1．仪器： 0.1ml、1ml、5ml移液管；试管14个；分光光度计等。 2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液；
（2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。 （4）样品液：健康人血清。

37 四、操作步骤 1．0~100μg／mL标准曲线的制作：
取14支具塞试管，分成两组，编号后，按下表加入试剂（6-11管与0-5管重复），将各试管中溶液混匀，室温静置5min后，以管0为空白对照，在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

38 管号 1 2 3 4 5 蛋白质标准液（ml） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.9%NaCl溶液（ml） 1.0 0.9 0.8
表1 各管加入的各种试剂量： 管号 1 2 3 4 5 蛋白质标准液（ml） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.9%NaCl溶液（ml） 1.0 0.9 0.8 0.7 考马斯亮蓝染液 蛋白质含量（μg） 10 20 30 40 60 A595

39 2．样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

40 计算 样品的蛋白质含量（μg/g鲜重）=[查得的蛋白质含量（μg） / [ 样品鲜重（g）]

41 五、注意事项 1. 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~30min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
2．用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇清洗。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 3．若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。

42 7. 思考题 1）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？ 2）如何正确使用分光光度计？
3）测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理有哪些不同？