流式细胞仪 基本原理和应用 秦鸿雁 第四军医大学 医学遗传学与发育生物学教研室.

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1 流式细胞仪 基本原理和应用 秦鸿雁 第四军医大学 医学遗传学与发育生物学教研室

2 概念特点 1 操作流程 2 流式应用 3 注意事项 4

3 FACScalibur 4 colors FACScantoII 8 colors
流式细胞仪的概念 流式细胞仪（Flow cytometer）:集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器. 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以定量分析的技术，同时可以对特定群体加以分选。 FACScalibur 4 colors FACScantoII 8 colors FACS Aria cell sorter 8~16 colors

4 流式细胞仪的特点 检测速度快，分析样本量大 可同时获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确 定性或定量分析细胞 强大的分选功能

5 流式细胞仪的检测样本 样本来源 各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等
血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 样本制备 单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） 5×105～1×107cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤

6 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞大小 细胞粒度 细胞活性 细胞表面面积 细胞内细胞因子
核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 。。。 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 。。。

7 流式细胞仪的散射光信号 当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方
向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散射 光信号（SSC）。

8 前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性

9 流式细胞仪的荧光素信号 使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量

10 Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP)
如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？ 滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围 Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP) SP 500 LP 500 BP 500/50

11 FACSCalibur光学滤片 检测器组 （激光器） PMT位置 带通/长通透镜 适用染料 488nm蓝色激光 FL1 530/30
FITC FL2 585/42 PE, PI FL3 670 LP PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7 635nm红色激光 FL4 661/16 APC

12 流式细胞仪的操作流程---单细胞染色

13 单细胞染色的对照设置 NRS block or FcγR inhibitor
空白对照（unstained cell ）: 消除自发荧光的干扰 * 自发荧光：即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强 单色荧光染色（single color staining）：特异荧光染色和非特异荧光染色 * 特异荧光：抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光； * 非特异荧光：即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光。 NRS block or FcγR inhibitor

14 单细胞染色的对照设置 同型对照（Isotype Control） 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型
（即Fc段相同， F(ab’)2段不同） 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（ γ2a），并分别标记FITC和PE

15 单细胞染色的荧光抗体选择 根据流式细胞仪类型选择荧光染料抗体。对BD FACScalibur, 可选择4色抗体，FITC， PE， PerCP和APC 根据抗原表达量选择荧光染料。FITC和PerCP为荧光比较弱的抗体，PE，PE-Cy5和APC为荧光比较强的抗体。对于表达量较少的分子，建议使用荧光信号强的染料抗体 尽量使用直标抗体。一步染色，影响因素少，结果准确 抗体滴度或标记量得选择。按抗体说明书选择抗体标记量或浓度，最好在实验前进行抗体滴度确定的预实验 在多色染色中，为减少补偿的调节，尽量选择荧光光谱重叠越少的荧光抗体组合。如PE和APC，FITC和APC， PE-Cy5.5和APC APC FITC

16 Spectral overlap Compensation

17 荧光补偿 （Compensation） 荧光补偿（compensation）：是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和/或其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行细胞染色 No. Antibody Isotype Mouse anti-human 未免疫Mouse 血清纯化而来 1 A-FITC（γ1） γ1-FITC 2 B-PE（γ2a） γ2a-PE 分析类型 管 功能 加入的抗体 双色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE 2 Compensation1 A-FITC 3 Compensation2 B-PE 4 Sample1,2……

18 FL1单染补偿管

19 FL2单染补偿管

20 荧光补偿调节 所有补偿调为“0” 调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角” 依单阳群体调节荧光补偿

21 细胞染色数据采集 采集软件 Cell QuestPro Software （FACScalibur）
FACS Diva Software (FACSAria) 。。。

22 BD FACS AriaII FACSDiva software

23 细胞染色结果分析 数据显示 直方图（Histogram） 二维点图（Dot Plot） 等高线图（Contour Plot）
密度图（Density） 三维图（3D Plot） 。。。

24 流式细胞仪应用（一）：细胞分选 FACS Aria 仪器操作要点 Nozzle 大小的选择和清洁 Sort setup
Setting High Medium Low Frequency (kHZ) 87 60 30 Attenuation off on On Gap 6 10-12 Drop1 4th drop 3rd drop Sort setup Drop delay setup Sorting Purity Continuous

25 流式细胞仪应用（一）：细胞分选 Pre sort gating and hierarchy

26 流式细胞仪应用（一）：细胞分选 仪器的设置 分选后的细胞纯度≥ 95%
Spleen +LN After-sorted naive T Pre-sorted CD4+ CD4+7AAD- CD4 CD62L After-sorted memory T CD44 仪器的设置 分选后的细胞纯度≥ 95% 根据实验目的的不同，选择重悬细胞的buffer。如继续培养的细胞，重悬于含2%FCS的RPMI培养液中；如用于移植实验，重悬于PBS中；如直接用于提取分子生物学实验，重悬于FACS soultion 中

27 流式细胞仪应用（二）： 细胞中DNA含量的测定
需要用RNase去除双链RNA的干扰 染色前要求用乙醇固定或者用NP40等试剂破膜以使细胞可以着色 检测流速用低速 控制CV值，8%以内可信，最好5%以内 乙醇固定后有时细胞会出现严重的粘附现象，可能是由于死亡细胞的DNA在固定之前外漏引起，可于固定前将细胞悬浮于4ug/ml的DNase中 细胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。 200 400 600 800 1000 G0/G1 s G2/M DNA分析 DNA含量 细胞数量 2N 4N

28 流式细胞仪应用（三）：细胞增殖 CFSE单参数法
CFDA-SE是一种非极性分子，进入细胞后可以被分解成CFSE，不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基结合； 被CFDA-SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。当细胞分裂时, CFSE标记物平均分配到两个子代细胞，因此其荧光强度是亲代的一半 尽量使细胞标记均匀 药物处理浓度不宜过大

29 流式细胞仪应用（三）：细胞凋亡 PI染色：在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰 设置好对照。空白对照和补偿对照 用于活细胞检测
AnnexinV 染色：Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）高亲和力特异性结合 设置好对照。空白对照和补偿对照 用于活细胞检测 因为Annexin V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，因此消化细胞时建议采用不含EDTA的消化液，或者消化后要用PBS充分洗涤细胞 PI staining

30 流式细胞仪应用（四）：细胞因子胞内染色 原理：
Brefeldin (BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运，使得细胞因子聚集和蓄积，增强细胞因子信号能被流式细胞仪检测。 RFP+ T cells RFP- T cells Without stimulation PMA + Ionomycin IL-2 IL-4 IFN-r 程序： ※ 收获细胞 ※ 阻断Fc 受体 ※ 细胞表面分子染色 ※ 固定和破膜 ※ 胞内细胞因子染色 质量控制： 保持胞内通透性，保证固定和通透细胞膜的试剂不影响 抗原和抗体的结合 （推荐BD公司的胞内染色Kit）。

31 注意事项 样 品 准 备 样 品 染 色 样 品 收 集 用NRS进行封闭； 调补偿； 用最适抗体浓度进行染色；
样 品 准 备 样 品 染 色 样 品 收 集 必须制备单细胞悬液。上机前过滤，并稍稍振荡。尤其是在细胞分选时，可考虑2到3次的过滤。 用NRS进行封闭； 用最适抗体浓度进行染色； 设立unstained 样品，single staining 样品，不同荧光抗体组合染色样品； 染色过程中避光；不时轻轻tap样品 调补偿； 根据细胞表面抗原表达量的多少确定收集的细胞数； 正确设定gate和region

32 Thank You!