第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法

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1 第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法
第十三章分子生物学技术 第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、分子杂交及相关技术 第三节、聚合酶链反应的原理和应用 第四节、基因定位的常用方法

2 分子生物学技术 70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。

3 现代分子遗传学发展 重要事件 1996酵母基因组序列 1956HbsGlu-Val 1972重组质粒 1986位置克隆
1944DNA是遗传物质 第一个R酶 1983HD病G定位 1949Hbs贫血 1966遗传密码 1953双螺旋 1975DNA杂交 现代分子遗传学发展 重要事件 1977DNA测序 1981转G小鼠 1985PCR 1987G剔除小鼠 1989位置克隆 1990第一个基因治疗 1995细菌G组序列

4 第一节 重组DNA技术-基因工程 重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。

5 一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。

6 1、限制酶的命名 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号
属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。

7 2、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。 如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’
如：Hare Ⅲ 5’-GGCC-3’ Bam HI 5’-GGATCC-3` 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 　　 切割形成 粘性末端（sticky end）交错切。

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9 部分常用限制酶及切点

10 互补末端连接

11 产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式：
1)用同一种限制酶切割； 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。

12 3、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：
1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 3) Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。

13 二、基因运载体及其选择 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。

14 载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；
常用的载体有：质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。

15 （一）.质粒plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 PBR322 大肠杆菌 pSC101
 Plasmid chromosome   COIEI plasmid 革兰氏阴性菌 pc194 scp12 真核生物-酵母质粒

16 常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。 EcoRI HindIII LacZ pUC19 Ori复制起点 APR

17  （二）.λ-噬菌体(λphage) 是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。 改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：

18 1、置换λ载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。 2、插入λ载体 – 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。

19 裂解途径

20 （三）.粘粒(cosmid vector) （30～40kb）
是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid –而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30～45kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。

21 (四) 大片段DNA克隆载体 人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。

22 1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）
优点：能携带大片段DNA，约300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 >300kbDNA片段。

23 2、噬菌体PI载体和PAC PI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110～115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。 1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-----PAC。

24 3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）
适用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb。

25 YAC 的主要功能成份有三： 1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。
3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。

26 三、DNA重组与分子克隆化 为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。

27 基本原理与过程： 1、分离纯化目的基因 2、目的基因 + vector =重组DNA分子 3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。
　1、分离纯化目的基因 　2、目的基因 + vector =重组DNA分子 　3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 　4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 　5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。

28 分离纯化目的基因 目的基因 + vector =重组DNA分子

29 重组　　DNA 和 分子 克隆

30 重组DNA和分子克隆的几种方法： （依目的基因的来源）
　1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 　2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 　3、化学合成目的基因进行克隆 　4、PCR体外扩增目的片段进行克隆

31 从基因组中分离目的基因在细胞中克隆

32 筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone）

33 筛查含有目的基因的细胞克隆

34 四、目的基因表达 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。
重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。 就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expression cloning）.

35 目的基因表达

36 （一）．真核细胞的基因在原核细胞 （细菌）中表达
原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆 菌为宿主。 真核多肽的表达要求： 1）适当的cDNA（完整的编码序列）； 2）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。  产物特征： 1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 2）活性受限或无活性。

37 (二)、真核细胞基因在真核细胞中表达 真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。
应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。 产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。

38 五 、基因文库 基因文库（gene library）,应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。

39 （一） 构建基因组DNA文库

40 （二）染色体特异的基因文库 （ chromosome specific library）
　　单个染色体 → 细胞克隆 （流式C仪） 　　↓ 细胞 → 染色体 　染色体文库 　 染色体区带 → 区带特异 （显微切割 ） 　 ↓ 　 DNA文库

41 （三）cDNA文库（cDNA library）
特定组织细胞一定发育阶段 总 mRNA