第七章 发酵工程制药.

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1 第七章 发酵工程制药

2 第七章 发酵工程制药 第一节 概 述 第二节 优良菌种的选育 第三节 发酵的基本过程 第四节 发酵方式 第五节 发酵工艺控制 第六节 发酵产物的提取 第七节 发酵设备 第八节 基因工程菌生长代谢的特点 第九节 基因工程在发酵工程中的应用 第十节 发酵工程的发展展望

3 第一节 概 述

4 一、发酵工程 二、发酵工程发展的4个阶段 三、发酵工程的研究内容

5 一、发酵工程 发酵工程（fermentation engineering）又称为微生物工程，是
利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术。 现代发酵工业已经形成完整的工业体系，包括抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、有机溶剂、多糖、酶制剂、单细胞蛋白、基因工程药物、核酸类物质及其他生物活性物质等的生产。

6 二、发酵工程发展的4个阶段 20世纪以前时期，人类利用传统的微生物发酵过程来生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等食品。
第一阶段： 20世纪以前时期，人类利用传统的微生物发酵过程来生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等食品。 巴斯德关于发酵作用的研究，从 1857年到1876年前后持续了近 20年。巴斯德以自己研究实践的科学结论说服了当时盛行的所谓“自 然发生学说”，他认为：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。发 酵是没有空气的生命过程。微生物是引起化学变化的作用者”。

7 二、发酵工程发展的4个阶段 第二阶段： 1900~1940年期间，随着微生物培养技术的不断进步，新的发酵产品不断问世。新产品主要有甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。

8 二、发酵工程发展的4个阶段 第三阶段： 发酵工业大发展时期，青霉素工业化成功推动了发酵工业的发展。
主要标志有：深层培养、生产大规模化，多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功，甾体的微生物转化。采用纯种发酵，进行无菌操作，对操作条件有严格的控制，相应地采用较复杂的工艺和装备。 以青霉素工业生产为标志的深层通气培养法的建立标示了发酵工程发展的一次新飞跃，这一飞跃发生在1942年。

9 二、发酵工程发展的4个阶段 基因工程等高新技术应用阶段。
第四阶段： 基因工程等高新技术应用阶段。 分子生物学和基因工程、细胞工程等新技术的发展将进一步加深对微生物代谢产物生物合成的遗传学与调节机制的了解，从而也为这些新技术在此领域中更好地应用创造了条件。 为了提高产物的单位产量，或有可能针对解除某一“限速步骤”，提高有关生物合成酶的表达水平或改变其调节机制，大大减少传统育种方法的随机性。 在开发新品种方面，重组DNA和细胞融合技术不仅能在不同的程度上打破生物种属间的屏障，获得“杂交”分子的新产物，而且通过活化微生物的某些沉默基因，也可能获得一些新结构的活性物质。

10 三、发酵工程的研究内容 发酵工程内容： 涉及菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制等。 发酵工业的生产水平取决于三个要素： 生产菌种、发酵工艺和发酵设备。

11 第二节 优良菌种的选育

12 育种方法，还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程 等定向育种 方法。
菌种选育包括自然选育、诱变育种、杂交育种等经验 育种方法，还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程 等定向育种 方法。

13 一、菌种选育的物质基础 决定遗传性状的DNA主要集中在染色体上，只有少许游离在外。
的根据。质粒也是遗传物质，它是染色体外的遗传结构。许多质粒携带 一些能影响宿主细胞类型的基因，例如用来控制抗生素的形成。

14 二、自然选育 1．自然选育的概念： 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称 为自然选育。 2. 正变菌株：
2. 正变菌株： 由于微生物可以发生自发突变，所以菌种在群体培养过程 中会产生变异个体。变异个体生长良好，生产水平提高，对生 产有利，这类菌株称为正变菌株； 负变菌株： 变异个体生产能力下降，形态出现异型，生产水平下降，导 致菌种退化，这类菌株称为负变菌株。 自然选育就是将正变菌株挑选出来，进行扩大培养。

15 二、自然选育 3. 自然选育的优点： 可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产水平、提高产物 产量的目的。 4. 自然选育的缺点：
效率低，进展慢。

16 三、诱变育种 用人工方法来诱发突变是加速基因突变的重要手段，它的突 变率比自然突变提高成千上百倍。突变发生部位一般是在遗传物
质DNA上，因此突变后性状能稳定地遗传。

17 三、诱变育种 诱变育种的方法和原理 通常用物理、化学、生物等因素进行对微生物诱变，导致遗传物 质DNA结构上发生变化。
（1）诱变机制 由诱变而导致微生物DNA的微细结构发生的变化，主要分为： ①微小损伤突变 ②染色体畸变即大损伤突变 ③染色体组突变三种类型。

18 三、诱变育种 1. 诱变育种的方法和原理 诱变剂：能诱发基因突变并使突变率提高到超过自发突变水平的 物理化学因子都称为诱变剂。
（2）诱变剂 诱变剂：能诱发基因突变并使突变率提高到超过自发突变水平的 物理化学因子都称为诱变剂。 诱变剂可分为物理、化学、生物诱变剂三大类。

19 三、诱变育种 1. 诱变育种的方法和原理 ①物理诱变剂 主要有紫外线、X射线、γ射线、快中子、α射线、β射线
（2）诱变剂 ①物理诱变剂 主要有紫外线、X射线、γ射线、快中子、α射线、β射线 和超声波等。其中以紫外线应用最广。

20 三、诱变育种 1. 诱变育种的方法和原理 ②化学诱变剂 包括金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、生长刺
（2）诱变剂 ②化学诱变剂 包括金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、生长刺 激素、抗生素及高分子化合物、杀菌剂、染料等。

21 三、诱变育种 1. 诱变育种的方法和原理 （2）诱变剂 ③生物诱变剂 转导作用 转化作用 转座作用

22 三、诱变育种 2. 诱变和筛选 诱变育种主要有诱变和筛选两步。 高产量或菌体量），其次是制定合理步骤，再次是建立正确快速的测
在具体进行某一项工作时首先要制定明确的筛选目标（如：提 高产量或菌体量），其次是制定合理步骤，再次是建立正确快速的测 定方法和摸索培养最适条件。

23 四、原生质体融合 原生质体融合就是把两个亲株分别通过酶解去除细胞壁，使菌体细
胞在高渗环境中释放出由原生质膜包被着的球状体，在高渗条件下混合两 个亲株的原生质体，由聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)作为助融剂使 它们相互凝集发生细胞融合，接着两亲株细胞基因组由接触到交换，从而 实现遗传重组，在再生细胞中就有可能挑选到较理想的重组子。

24 五、基因工程定向育种 第26讲 主讲教师：董洪钵　　　　　　　学时32　　　　　　　　　　

25 第三节 发酵的基本过程

26 一、菌种 要求用于生产的菌种产量高、生长快、性能稳定、容易培养。 目前国内外发酵工业中所采用的菌种绝大多数是经过人工选育的优良
发酵的基本过程为：菌种→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取精制。 要求用于生产的菌种产量高、生长快、性能稳定、容易培养。 目前国内外发酵工业中所采用的菌种绝大多数是经过人工选育的优良 菌种。为了防止菌种衰退，生产菌种必须以休眠状态保存在砂土管或冷冻 干燥管中，并且置于0~4℃恒温冰箱（库）内。使用时可临时取出，接种 后仍需冷藏。生产菌种一般都严格规定其使用期，一般砂土管为1~2年。 生产菌种应不断纯化，淘汰变异菌落，防止衰退。

27 二、种子的制备 够数量的菌体，以便接种到发酵罐中。 种子制备可以在摇瓶中或小罐内进行，大型发酵罐的种子要经过两次 扩大培养才能接入发酵罐。
种子是发酵工程开始的重要环节。这一过程是使菌种繁殖、以获得足 够数量的菌体，以便接种到发酵罐中。 种子制备可以在摇瓶中或小罐内进行，大型发酵罐的种子要经过两次 扩大培养才能接入发酵罐。

28 三、发酵 阶段。 发酵一般是在钢制或不锈钢的罐内进行，有关设备和培养基应事先经
这一过程的目的是使微生物产生大量的目的产物，是发酵工序的关键 阶段。 发酵一般是在钢制或不锈钢的罐内进行，有关设备和培养基应事先经 过严格灭菌，然后将长好的种子接入，接种量一般为5％~20％。在整个发 酵过程中要不断地通气、搅拌、维持一定的罐温、罐压，并定时取样分析 和无菌试验，观察代谢和产物含量情况，有无杂菌污染。

29 四、产物提取 物外，还有残余的培养基、微生物代谢产生的各种杂质和微生物的菌体等。 提取过程包括以下三个方面： ①发酵液的预处理和过滤。
发酵完成后得到的发酵液是一种混合物，其中除了含有表达的目的产 物外，还有残余的培养基、微生物代谢产生的各种杂质和微生物的菌体等。 提取过程包括以下三个方面： ①发酵液的预处理和过滤。 ②提取。 ③精制。

30 第四节 发酵的方式

31 微生物的发酵方式可分为分批发酵、补料分批发酵和连续发酵。
在制备大量微生物菌体或其代谢产物时，可采用不同的发酵方式。 微生物的发酵方式可分为分批发酵、补料分批发酵和连续发酵。

32 一、分批发酵 简单分批发酵是将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过
若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作过程。放料后再重复投料、灭 菌、接种、发酵过程。 它以微生物生长、各种基质消耗和代谢产物合成都处于瞬变之中为特征 ，整个发酵过程处于不稳定状态。 分批发酵过程中的pH、温度、溶氧浓度以及多种营养物质浓度都可作 为控制变量加以优化。 一、分批发酵

33 二、补料分批发酵 后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 所补材料可为全料（基础培养基）或简单的碳源、氮源及前体等。
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间 后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 所补材料可为全料（基础培养基）或简单的碳源、氮源及前体等。

34 三、连续发酵 浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间 断的培养，发酵反应器中的细胞总数和总体积均保持不变，发酵
连续发酵是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体 浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间 断的培养，发酵反应器中的细胞总数和总体积均保持不变，发酵 体系处于平衡状态，发酵中的各个变量都能达到恒定值而区别于 瞬间状态的分批发酵。

35 第五节 发酵工艺控制

36 一、培养基的影响及其控制 称为培养基。 微生物的生长需要较多供给构成有机碳架的碳源，构成含氮
细胞的生长需要一定的营养，用于维持细胞生长的营养基质 称为培养基。 微生物的生长需要较多供给构成有机碳架的碳源，构成含氮 物质的氮源气，其次还需要一些含磷、镁、钾、钙、钠、硫等的 盐类以及微量的铁、铜、锌、锰等元素。 配制培养基的成分应包括碳源、氮源、无机盐和水等物质。

37 一、培养基的影响及其控制 适 应 期 对数 生长期 静止期 二次生长 细胞自溶 T Lnc 细菌生长对数曲线

38 一、培养基的影响及其控制 μ：细菌比生长速率 α：细菌自溶率 X：菌体浓度 μm：最大比生长速率 kS：细菌对基质的亲和系数 S：基质浓度

39 一、培养基的影响及其控制 基质抑制作用 ： 由莫氏方程可以看出随着底物浓度的增加，比生长速 率μ逐渐趋近，但事实上当底 物浓度的增加到一定数值后 ，会出现比生长速率下降的情况，这种效应通常称为基质 抑制作用。

40 一、培养基的影响及其控制 竞争性抑制 μ：细菌比生长速率 X：菌体浓度 μm：最大比生长速率 kS：细菌对基质的亲和系数 S：基质浓度
I：抑制剂浓度 ki：抑制剂与菌体的亲和系数 竞争性抑制

41 一、培养基的影响及其控制 非竞争性抑制 μ：细菌比生长速率 μm：最大比生长速率 kS：细菌对基质的亲和系数 S：基质浓度 I：抑制剂浓度
ki：抑制剂与菌体的亲和系数

42 一、培养基的影响及其控制 碳源是构成微生物细胞和各种代谢产物碳架的营养物质，同 时碳源在微生物代谢过程中被氧化降解，释放出能量，并以ATP
1.碳源 碳源是构成微生物细胞和各种代谢产物碳架的营养物质，同 时碳源在微生物代谢过程中被氧化降解，释放出能量，并以ATP 形式贮存于细胞内，供给微生物生命活动所需的能量。 生产中使用的碳源有糖类、脂肪、有机酸、碳氢化合物。常 用的糖类有单糖、双糖和多糖。

43 一、培养基的影响及其控制 氮源是构成菌体细胞物质，也是细胞合成氨基酸、蛋白质、核 酸、酶类及含氮代谢产物的成分。选择氮源时需要注意氮源促进菌
2.氮源 氮源是构成菌体细胞物质，也是细胞合成氨基酸、蛋白质、核 酸、酶类及含氮代谢产物的成分。选择氮源时需要注意氮源促进菌 体生长、繁殖和合成产物间的关系。 氮源有无机氮源和有机氮源两大类。 常用的有机氮源有黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨、 酵母粉。

44 一、培养基的影响及其控制 3.无机盐和微量元素 各种无机盐和微量元素的主要功能是：构成菌体原生质的成分（如磷、硫
等），作为酶的组成部分或维持酶的活性（如镁、锌、铁、钙、磷等），调节 细胞的渗透压（如NaCl、KCl等）和pH，参与产物合成（磷、硫等）。 4．水 培养基必须以水为介质，它既是构成菌体细胞的主要成分，又是一切营养 物质传递的介质，所以水的质量对微生物的生长繁殖和产物合成有很重要的作 用。

45 二、温度的影响及其控制 一方面是影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质。 另一方面是影响发酵液的物理性质，如发酵液的黏度、基质和氧
温度的变化对发酵过程可产生两方面的影响： 一方面是影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质。 另一方面是影响发酵液的物理性质，如发酵液的黏度、基质和氧 在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等，进 而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。 因此温度对菌体的生长和合成代谢的影响是极其复杂的，要综合 考察它对发酵的影响。

46 二、温度的影响及其控制 在发酵过程中，既有产生热能的因素，又有散失热能的因素，因 而引起发酵温度的变化。
1. 影响发酵温度变化的因素 在发酵过程中，既有产生热能的因素，又有散失热能的因素，因 而引起发酵温度的变化。 产热的因素有生物热和搅拌热，散热的因素有蒸发热、辐射热和 显热。 产生的热能减去散失的热能，所得的净热量就是发酵热，它就是 发酵温度变化的主要因素。

47 二、温度的影响及其控制 （1）生物热：微生物在生长繁殖过程中产生的热能，称为生物热。
1. 影响发酵温度变化的因素 （1）生物热：微生物在生长繁殖过程中产生的热能，称为生物热。 （2）搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所 产生的热量，即搅拌热。 （3）蒸发热：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，排出引起水分蒸 发所需的热能，即为蒸发热。 （4）辐射热：由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热 能通过罐体向大气辐射的热量，即为辐射热。

48 二、温度的影响及其控制 2. 温度的选择与控制 （1）最适温度的选择 （2）温度的控制

49 三、溶氧的影响及其控制 采取通气发酵，适量的溶解氧可维持其呼吸代谢和代谢产物的合成。
大部分工业微生物需要在有氧环境中生长，培养这类微生物需要 采取通气发酵，适量的溶解氧可维持其呼吸代谢和代谢产物的合成。 对大多数发酵来说，供氧不足会造成代谢异常，降低产物产量。

50 三、溶氧的影响及其控制 溶氧是需氧发酵控制的最重要参数之一。氧在水中的溶解度很小
1.溶氧的影响 溶氧是需氧发酵控制的最重要参数之一。氧在水中的溶解度很小 ，所以需要不断通气和搅拌，才能满足溶氧的要求。溶氧的大小对菌 体生长和产物的性质及产量都会产生不同的影响。 需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。溶氧高虽然有利于菌体生长和产 物合成，溶氧太大有时反而抑制产物的形成，因此，为避免发酵处于 限氧条件下，须要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度， 并使发酵过程保持在最适浓度。最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合 成代谢的特性有关，具体须由实验来确定。

51 三、溶氧的影响及其控制 在发酵过程中，在已有设备和正常发酵条件下，每种产物发酵的 溶氧浓度变化有自己的规律。
2. 发酵过程的溶氧变化 在发酵过程中，在已有设备和正常发酵条件下，每种产物发酵的 溶氧浓度变化有自己的规律。 发酵时生产菌大量繁殖，需氧量不断增加，此时的需氧量超过供 氧量，使溶氧浓度明显下降。 从发酵液中的溶解氧浓度的变化，就可以了解微生物生长代谢是 否正常，工艺控制是否合理，设备供氧能力是否充足等问题，帮助查 找发酵不正常的原因和控制好发酵生产。

52 三、溶氧的影响及其控制 3. 溶氧浓度的控制 发酵液的溶氧浓度，是由供氧和需氧两方面所决定的。也就是说，当发
酵的供氧量大于需氧量，溶氧浓度就上升，直到饱和；反之就下降。因此要控 制好发酵液中的溶氧浓度，需从这两方面着手。 在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数的值。 在可能的条件下，采取适当的措施来提高溶氧浓度，如调节搅拌转速或通气速 率来控制供氧。

53 三、溶氧的影响及其控制 3. 溶氧浓度的控制 供氧量的大小还必须与需氧量相协调，
发酵液的需氧量受菌体浓度、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响 。 其中以菌浓的影响最为明显。 可以控制菌的比生长速率比临界值略高一点的水平，达到最适浓度。这是控 制最适溶氧浓度的重要方法。 可以通过控制基质的浓度来实现。除控制补料速度外，在工业上，还可采用调 节温度（降低培养温度可提高溶氧浓度）、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂 等工艺措施，来改善溶氧水平。

54 四、pH的影响及其控制 发酵培养基的pH影响微生物生长及发酵过程中各种酶活。 不同的微生物发酵有各自的最适生长pH和最适生产pH。
都在8.5左右，超过此上限，微生物将无法忍受而自溶；下限以酵母为 最低，是2.5。但菌体内的pH一般认为是中性附近。

55 四、pH的影响及其控制 在发酵过程中，pH的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培

56 四、pH的影响及其控制 （1）发酵pH的确定 微生物发酵的合适pH范围一般是在5~8之间，由于发酵是多酶复

57 四、pH的影响及其控制 （2）pH的控制 ①首先考虑和试验发酵培养基的基础配方，配比适当，使发酵过
生酮酸）和产碱（如NaNO3、尿素）的物质以及缓冲剂（如CaCO3） 等成分，它们在发酵过程中影响pH。 ②在发酵过程中直接加酸或碱和补料 。 现在常用的是以生理酸性物质（NH4）2SO4 和碱性物质氨水来控制。

58 第六节 发酵产物的提取

59 提取过程：是指发酵液中的微生物代谢产物初步抽提、浓缩和纯化。
提取方法：一般包括吸附法、沉淀法、溶剂萃取法、离子交换法等。

60 一、吸附法 利用适当的吸附剂（如活性炭，白土、氧化铝等），在一定的 pH下，使发酵液中的抗生素被吸附剂吸附，然后改变pH，以适当
1. 概念： 利用适当的吸附剂（如活性炭，白土、氧化铝等），在一定的 pH下，使发酵液中的抗生素被吸附剂吸附，然后改变pH，以适当 的洗脱剂（一般为有机溶剂）把抗生素从吸附剂上解吸下来，以 达到浓缩和提纯的目的，称为吸附法。

61 一、吸附法 操作简单、原料易解决、成本低。 2. 吸附法的优点： 3. 吸附法的缺点：
吸附性能不稳定、选择性不高、不能连续操作、劳动强度大。

62 二、沉淀法 时从溶液中游离沉淀出来或在一定pH条件下，能与某些酸、碱或 金属离子形成不溶性或溶解度很小的复盐，使抗生素从发酵滤液
1. 概念： 沉淀法是指利用某些抗生素具有两性的性质，使其在等电点 时从溶液中游离沉淀出来或在一定pH条件下，能与某些酸、碱或 金属离子形成不溶性或溶解度很小的复盐，使抗生素从发酵滤液 中沉淀析出，以及改变 pH等条件时，此种复盐又易分解或重新溶 解的特性，来提取抗生素的一种方法。

63 二、沉淀法 2. 沉淀法的优点： 设备简单、原料易解决、节省溶剂、成本低、收率高。 3. 沉淀法的缺点： 过滤较困难、产品质量比溶剂法差。

64 三、溶剂萃取法 利用抗生素在不同的pH条件下以不同的化学状态（游离酸、 碱或成盐状态）存在，以及它们在水及与水不互溶的溶剂中溶解
1. 概念： 利用抗生素在不同的pH条件下以不同的化学状态（游离酸、 碱或成盐状态）存在，以及它们在水及与水不互溶的溶剂中溶解 度不同的特性，使抗生素从一种液体转移到另一种液体中去，以 达到浓缩和提纯的目的。这种提取方法称为溶剂萃取法。

65 三、溶剂萃取法 浓缩倍数大、产品纯度高、能进行连续生产、生产周期短。 2. 溶剂萃取法的优点： 3. 溶剂萃取法的缺点：
设备要求高、溶剂消耗大、成本较高。

66 四、离子交换法 利用某些抗生素能离解为阳离子或阴离子的特性，使其与离子 交换树脂进行选择性交换作用，再用洗脱剂（一般为酸、碱或有
1. 概念： 利用某些抗生素能离解为阳离子或阴离子的特性，使其与离子 交换树脂进行选择性交换作用，再用洗脱剂（一般为酸、碱或有 机溶剂）从树脂上将抗生素洗脱下来，以达到浓缩和提纯的目的。

67 四、离子交换法 成本低、设备较简单、操作方便、节约大量有机溶剂。 2. 离子交换法的优点： 3. 离子交换法的缺点：
生产周期长、pH变化较大。

68 第七节 发酵设备

69 理想的微生物细胞生物反应器必须具备如下一些基本要求：
（1）制造生物反应器所采用的一切材料稳定性要好，对微生物必须无毒 性，一般要用 不锈钢制成； （2）密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染； （3）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能； （4）生物反应器内壁及管道焊接部位平整光滑和无裂缝，以减少微生物的沉积，利于 清洗，消除灭菌死角； （5）所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留“死腔”，任何接口处均不 得有泄漏； （6）搅拌器转速和通气应适当； （7）对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高。

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79 第八节 基因工程菌生长代谢的特点

80 菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子——核酸和蛋白
质合成的综合表现，通常用比生长速率来表示。 控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积 累、提高外源蛋白产率都有重要意义。

81 对菌体生长的调控主要有两种观点： 一种观点认为能量的供应决定了菌体的最大比生长速率； 另一种观点认为是小分子前体和催化组分（如RNA聚合酶、核糖 体等）的限制决定了菌体的最大比生长速率。 这两种观点分别从能量和合成反应的前体这两个不同的角度 研究菌体的生长。

82 一、菌体生长与能量的关系 在这种培养中的最大比生长速率。 2. 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，由
1.各种碳源通过有限的呼吸能力所能提供的最大能量决定了菌体 在这种培养中的最大比生长速率。 2. 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，由 于呼吸链或三羧酸循环的功能不足，使部分乙酰辅酶A通过转 化为乙酸来供能，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。 3. 分批培养中选用不同的碳源，补料培养中控制补料速度，连续 培养中通过控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制 菌体的生长。

83 二、菌体生长与前体供应的关系 1. 在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高和蛋白合成增加。
2. 各个基因互相竞争共同的前体和催化功能。

84 第九节 基因工程在发酵工程中的应用

85 一、基因工程在抗生素生产中的应用 提高微生物产生抗生素的能力常用的方法是用诱变剂单独或复合处 理（如紫外线、化学试剂等）微生物.
80年代，分子生物学技术应用于结构比较复杂的次级代谢产物的生 物合成，并通过DNA重组技术，在适宜的宿主菌中将特定的抗生素基因 进行重组，产生了几种新的“杂合”抗生素(hybrid antibiotic)。 当今已对一些抗生素的生物合成基因和抗性基因的结构、功能、表 达和调控有了较深入的了解，

86 一、基因工程在抗生素生产中的应用 1.抗生素生物合成基因的结构特点： （1）链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是高G-C碱基组成，（G
十C）含量达70％以上；三联体密码子中的第三个碱基的G、C比例极高。 （2）抗生素生物合成基因大多处于一个基因簇中，参与每种抗生素生物合成的基 因为10~30个，几乎总是成簇存在的，不仅包括生物合成酶结构基因，也包 括抗性基因、调节基因、抗生素分泌和与胞外处理功能有关的基因。

87 几种典型的抗生素生物合成基因的结构

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89 一、基因工程在抗生素生产中的应用 （1）在标准宿主系统中克隆检测单基因产物。 （2）阻断变株法。 （3）突变克隆法。 （4）直接克隆法。
2.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法： （1）在标准宿主系统中克隆检测单基因产物。 （2）阻断变株法。 （3）突变克隆法。 （4）直接克隆法。 （5）克隆抗生素抗性基因法。 （6）寡核苷酸探针法。 （7）同源基因杂交法。

90 一、基因工程在抗生素生产中的应用 （1）增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数 （2）通过调节基因的作用 （3）增加抗性基因
3.提高抗生素的产量 （1）增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数 （2）通过调节基因的作用 （3）增加抗性基因

91 一、基因工程在抗生素生产中的应用 许多抗生素产生菌可以产生多组分抗生素，由于这些组分的化
4.改善抗生素组分 许多抗生素产生菌可以产生多组分抗生素，由于这些组分的化 学结构和性质非常相似，而其生物活性有时却相差很大，这给有效 组分的发酵、提取和精制带来很大不便。随着对各种抗生素生物合 成途径的深入了解以及基因重组技术的不断发展，应用基因工程方 法可以定向地改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。

92 一、基因工程在抗生素生产中的应用 抗生素的生物合成一般对氧的供应较为敏感，不能大量供氧往往是高产发 5.改进抗生素生产工艺
酵的限制因素。为了使细胞处于有氧呼吸状态， 传统方法往往只能改变最适操作条件、降低细胞生长速率或培养密度。 利用重组DNA技术克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌中，在细胞中表达 血红蛋白，可望从提高细胞自身代谢功能入手解决溶氧供求矛盾，提高氧的 利用率，具有良好的应用前景。

93 一、基因工程在抗生素生产中的应用 应用基因工程技术改造菌种，产生新的杂合抗生素，这为微生
6. 产生杂合抗生素 应用基因工程技术改造菌种，产生新的杂合抗生素，这为微生 物药物提供了一个新的来源。杂合抗生素是通过遗传重组技术产生 的新的抗菌活性化合物。

94 一、基因工程在抗生素生产中的应用 7.组合生物合成 组合生物合成，是近年发展起来的技术，是在微生物次级代谢产物生物合成基因和酶学研究基础上形成的。 组合生物合成的基本过程是将不同来源的基因组合，在异源宿主细胞中进行基因表达，将宿主细胞产生的化合物分离提纯，对化合物的结构进行解析，推测生物合成规律。 组合生物合成的特点是： ①通过多个催化功能的组合完成复杂化合物的合成。 ②合成的化合物为天然产物及其衍生物。 ③适用于化学合成困难的复杂化合物。

95 二、基因工程在氨基酸生产中的应用 用经典的育种方法对其产生菌进行选育，工作量大、盲目性高， 而且不能把不同菌株中的优良性状组合起来。
发酵法生产的氨基酸是菌体的一系列酶作用的初级代谢产物。 用经典的育种方法对其产生菌进行选育，工作量大、盲目性高， 而且不能把不同菌株中的优良性状组合起来。 以大肠杆菌为主的基因工程技术在生产氨基酸方面的应用取得进 展，利用生物技术已得到了基因克隆的苏氨酸、组氨酸、精氨酸和异 亮氨酸等生产菌种。

96 二、基因工程在氨基酸生产中的应用 氨基酸工程菌的构建的主要策略有： ① 借助于基因克隆与表达技术，将氨基酸生物合成途径中的限速
① 借助于基因克隆与表达技术，将氨基酸生物合成途径中的限速 酶编码基因转入生产菌中，通过增加基因剂量提高产量。 ② 降低某些基因产物的表达速率，最大限度地解除氨基酸及其生 物合成中间产物对其生物合成途径可能造成的反馈抑制。 ③ 消除生产菌株对产物的降解能力，以及改善细胞对最终产物的 分泌通透性。

97 三、基因工程在维生素生产中的应用 人体所需要的维生素有13种之多，其中只有维生素B2、维生素
B12和维生素C是应用发酵工程来生产的，其余的都是用化学合成或 从天然物质中提取。 近年来，基因工程技术也应用到维生素合成中。

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99 第十节 发酵工程的发展展望

100 发酵工程技术近年重点发展的方向： ① 采用基因工程、细胞工程等先进技术，选育菌种，大幅度提高菌种的 生产能力。 ② 深入研究发酵过程，如过程中的生物学行为、化学反应、物质变化、 发酵动力学、发酵传递力学等，以探索选用菌种的最适生产环境和有 效的调控措施。 ③ 设计适合于合成目的产物的反应器和分离技术。

101 发酵工程产品的制造实例 一、青霉素 二、赖氨酸 三、维生素B2