第九章 食品中外源外源化学物致突变作用.

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1 第九章 食品中外源外源化学物致突变作用

2 主 要 内 容 一 基本概念 二 化学毒物致突变的类型 三 致突变作用机制和后果 四 化学毒物致突变作用的研究方法

3 一 基 本 概 念 变异(variation) 可遗传的变异：遗传物质变化引起的变异。 不遗传的变异：由环境引起的，遗传物质没有发生变化。
一 基 本 概 念 生物有机体的属性之一，表现为亲代与子代的差别。 可遗传的变异：遗传物质变化引起的变异。 不遗传的变异：由环境引起的，遗传物质没有发生变化。

4 突 变(mutation) 自发突变(spontaneous mutation):是由 于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。
遗传结构本身的变化及其引起的变异称为突变。 自发突变(spontaneous mutation):是由 于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。 特点：发生过程长、频率很低，高等生物的自发突变率为1×10—10～1×10—5，即每一世代在10万到100亿个配子中可能有一个突变发生 。 诱发突变(induced mutation)：是指人为地造成突变 。 特点：发生过程短、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。

5 遗传毒理学(Genetic Toxicology)
毒理学的一个分支，是研究外源化学物及其它环境因素对机体遗传机构的毒性作用的一门新科学。其主要目的是检测那些能引起DNA损伤的化学、物理等因素，研究其遗传毒作用的特点及对人类的潜在危害。

6 致突变作用 (mutagenesis) 致突变物 (mutagen)
是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说突变的发生及其过程即称为致突变作用。 致突变物 (mutagen) 凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子称为致突变物或诱变物，也称遗传毒物。

7 ➢具有很高的化学活性，其原型就可引起生物体突变的物质。
直接致突变物： ➢具有很高的化学活性，其原型就可引起生物体突变的物质。 间接致突变物： ➢本身不能引起突变，必须在体内经过　　 　代谢活化，才具有致突变性的物质。

8 回顾 DNA ﹢ ﹢ 磷酸根 碱基 脱氧核糖 ∥ 核苷酸

9 base O3P 脱氧核苷酸

10 多聚脱氧核苷酸链

11 基因（gene) 密码子 基因组（genome)
是带有一定遗传信息并能产生某种功能产物的DNA分子片段。是DNA分子中具有完整功能的最小单位。 密码子 　　三个碱基构成的三联密码叫密码子，体现了一个氨基酸信息；　　 …..TTA GGG GAC GCG CAT GAA… …..AAT CCC CTG CGC GTA CTT…. 基因组（genome) 一个物种或一个细胞中所有基因的整体组成。

12 染色质（chromatin) 染色体（chromosome)
间期细胞的细胞核内由ＤＮＡ、组蛋白、非组蛋白及少量ＲＮＡ组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式。 染色体（chromosome) 是指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚缩而成的棒状结构．

13 一 基 本 概 念 细胞周期 细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。 G1期：主要合成RNA和蛋白
一 基 本 概 念 细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。 G1期：主要合成RNA和蛋白 间期 S期: 主要合成DNA G2期: 主要合成RNA和蛋白 分裂期 M期: 有丝分裂期

14 末期 DNA(染色质)复制 蛋白质合成 间期变化 后期 中期 前期

15 一 基 本 概 念 有丝分裂 减数分裂 指细胞核分裂的过程，一个细胞由此分裂生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体。
一 基 本 概 念 指细胞核分裂的过程，一个细胞由此分裂生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体。 减数分裂 指通过两次细胞分裂（即两个细胞周期）使细胞染色体减少一半的一种特殊的有丝分裂。有性生殖的个体在形成生殖细胞过程中采用减数分裂方式 。

16 一 基 本 概 念 有丝分裂 减数分裂

17 一 基 本 概 念 体细胞(somatic cell) 生殖细胞(germ cell) 往往是单倍体，其染色体改变即突变可传给下一代。
一 基 本 概 念 体细胞是一个相对于生殖细胞的概念，最初由受精卵分裂而得到，体细胞多是二倍体细胞，含有两套完全相同的染色体，其遗传损伤不会遗传给下一代。 生殖细胞(germ cell) 往往是单倍体，其染色体改变即突变可传给下一代。

18 二、化学毒物致突变的类型 从作用机制角度 基因突变 染色体畸变 染色体数目的改变

19 化学毒物致突变的类型 一、基因突变(gene mutation) 转换(transition) 颠换(transvertion)
基因中DNA序列的变化。因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。是遗传物质在分子水平的改变。 1．碱基置换(base substitution) 指DNA序列上的某个碱基被其他碱基所取代。 转换(transition) 颠换(transvertion)

20 化学毒物致突变的类型 碱基置换后果 １.同义突变 密码子的兼并性 密码发生突变，但所编码的氨基酸不变，即表型相同的基因型突变。
　　密码子的兼并性 密码发生突变，但所编码的氨基酸不变，即表型相同的基因型突变。 发生同义突变对机体无影响。

21 化学毒物致突变的类型 碱基置换后果 ２.错义突变
　　是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变 。 碱基置换 编码氨基酸信息的改变 基因产物改变 （Ａ氨基酸 Ｂ氨基酸） 基因产物可能失活

22 化学毒物致突变的类型 碱基置换后果 ３.无义突变 是编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后,变成不编码任何氨基酸的终止密码 。 碱基置换
　　是编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后,变成不编码任何氨基酸的终止密码 。 碱基置换 密码子改变 （氨基酸编码密码子 非编码的终止密码子） 蛋白质合成提前结束 基因产物不完全或无功能 基因产物不完全或无功能 基因产物不完全或无功能

23 化学毒物致突变的类型 一、基因突变(gene mutation) 1．碱基置换(base substitution)
2．移码突变 (frame shift mutation) 是DNA中增加或减少了一对或几对不等于 3的倍数的碱基对所造成的突变。 …..TTA GGG GAC GCG CAT GAA… …..AAT CCC CTG CGC GTA CTT…. …..TTA GGG GGA CGC GCA TGA A… …..AAT CCC CCT GCG CGT ACT T…. 　　发生移码突变后由于所编码的蛋白质的活性改变较大，故常出现致死性突变（突变造成死胎、自然流产和出生后天折等，称为致死性突变 ） 。

24 化学毒物致突变的类型 一、基因突变(gene mutation) 1．碱基置换(base substitution)
2．移码突变 (frame shift mutation) 3. 三核苷酸重复：特定三联核苷酸重复排列(不明原因的扩增) 4．大段损伤 是DNA序列上有较长的一段序列的重新分布，也称DNA重排。大段缺失或插入，这种损伤有时可跨越两个甚至数个基因。在大段损伤中，因缺失的片断远远小于光学显微镜可观察到的染色体缺失，故称小缺失。 三核苷酸重复:神经-肌肉系统退行性疾病

25 化学毒物致突变的类型 二、染色体畸变 染色单体型畸变 染色体型畸变 指染色体结构的改变，是遗传物质大的改变，由染色体和染色单体断裂所致。
能使染色体或染色单体发生断裂的物质称为断裂剂。

26 化学毒物致突变的类型 二、染色体畸变 2.缺失 1.倒位 臂间倒位 臂内倒位 3.重复 4.易位 单方易位 相互易位

27 化学毒物致突变的类型 三、染色体数目异常 整倍体畸变 非整倍体畸变 非整倍体畸变指细胞丢失或增加一条或几条染色体。
染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成单倍体、三倍体、四倍体等。 非整倍体畸变 非整倍体畸变指细胞丢失或增加一条或几条染色体。

28 第三节 致突变作用的机制及后果 一、DNA损伤 公认的致突变机制：DNA损伤-修复-突变
第三节 致突变作用的机制及后果 公认的致突变机制：DNA损伤-修复-突变 一、DNA损伤 DNA损伤：致突变物作用下，DNA结构和功能改变，阻碍转录、复制及翻译。一级结构、空间结构。 (一)由各种类型碱基损伤造成的突变 1、碱基错配 烷化剂提供烷基与DNA共价化合 烷化剂碱基引起DNA二级结构改变

29 2、平面大分子嵌入DNA链 DNA单链的碱基之间 静电吸附 化学物 嵌入 核苷酸链之间 多环的平面结构 移码突变

30 致突变作用的机制及后果 一、以DNA为靶的损伤机理 3、碱基类似物的取代 碱基类似物 细胞周期的S期(DNA合成期) 碱基类似物 正常碱基
碱基置换

31 致突变作用的机制及后果 一、以DNA为靶的损伤机理 (一)碱基错配 (二)平面大分子嵌入DNA链 (三)碱基类似物的取代
(四)改变或破坏碱基的化学结构 破坏或改变碱基结构 转换型碱基置换 化学物 碱基氧化 链断裂

32 致突变作用的机制及后果 一、以DNA为靶的损伤机理 (五) 二聚体的形成 (一)碱基错配 (二)平面大分子嵌入DNA链
(三)碱基类似物的取代 (四)改变或破坏碱基的化学结构 (五) 二聚体的形成 紫外线 细胞或机体 环丁烷嘧啶二聚体 DNA 阻止DNA复制 细胞死亡

33 致突变作用的机制及后果 一、以DNA为靶的损伤机理 (六)DNA加合物形成 共价键 1. 亲电性化合物 ＋ DNA 加合物 共价键 2.
烷化剂 ＋ DNA DNA甲基化或乙基化

34 致突变作用的机制及后果 一、以DNA为靶的损伤机理 (七)DNA-蛋白质交联物（DPC)形成 DNA 交联 DPC 蛋白质
铬、镍 交联 DPC 蛋白质 严重影响DNA构象与功能 高度基因突变、染色体断裂、致死 性突变现象

35 致突变作用的机制及后果 不以DNA为靶的损伤机理 二、对DNA合成和修复有关的酶系统作用 DNA复制保真性 DNA损伤 酶系统受损 引起突变

36 致突变作用的机制及后果 不以DNA为靶的损伤机理 四、整倍体和非整倍体的形成 （对纺锤体的毒作用） 不完全阻止 对纺锤体干扰 完全阻止 中期
后期 前期 不完全阻止 非整倍体突变 对纺锤体干扰 完全阻止 整倍体突变

37 致突变作用的机制及后果 五、诱变重组效应 重组剂：增加有丝分裂重组频率。 丝裂霉素和亚硝酸

38 六、突变的后果 致突变作用的机制及后果 突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞。
体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到 下一代。 生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代。

39 1.体细胞突变的后果 （1）癌变：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、易位、倒位等染色体畸变。 （2）致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果。 （3）其他不良后果：动脉粥样硬化、 衰老等

40 2.生殖细胞突变的后果 （1）对机体无影响，如同义突变; （2）导致对健康无影响的生化组成的遗传学差异; 非致死突变
（3）导致遗传易感性的改变; （4）导致先天畸形等遗传性疾病; （5）致死性突变，造成配子死亡、死胎及自发流产等。 致死突变

41 化学物和遗传危害示意图（图9.6） 突变的不良后果 体细胞突变 生殖细胞突变 良性肿瘤 恶性转化 细胞衰老 显性致死 隐性致死 存活突变
分化的胚胎细胞受损 未分化的胚胎细胞 显性致死 隐性致死 存活突变 动脉硬化 癌变 未知疾病 老化 流产死胎 出生缺陷基因负荷 出生缺陷(流产/死胎)癌变 出生缺陷(功能或结构畸形) 先天性疾病 化学物和遗传危害示意图（图9.6）

42 第四节 化学毒物致突变作用的 研究方法 一、观察项目的选择 （一）观察的效应终点类型
遗传学终点：试验观察到现象所反映的各种事件的统称，可分为三类：基因突变，染色体畸变；DNA损伤等其他遗传损伤的检测。实际工作中，没有一种致突变试验能涵盖所有的遗传学终点，故需用一组试验配套进行检测。 （二）成套的观测项目 测试方法取决测试方案制定的需要，试验方法入选原则：1.包含每一类型的遗传学终点；2.包括多种进化程度不同物种；3.体内试验与体外试验配合；4.包括体细胞和生殖细胞。

43 第四节 化学毒物致突变作用的 研究方法 组氨酸营养缺陷型突变株。(his-) 鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+) + 受试物
二、常用的致突变试验 (一)鼠伤寒沙门菌/组氨酸回复突变试验 细菌回复突变试验(Ames试验) 正向突变 组氨酸营养缺陷型突变株。(his-) 鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+) 回复突变 上清（S９） 大鼠肝 离心 ±代谢活化系统 + 匀浆 9000g 辅助因子 酶诱导剂 受试物 Ames试验原理图

44 一、常用的致突变试验 (一)细菌回复突变试验(Ames试验) TA97 TA98 四种标准测试菌株 TA100 TA102 移码突变
碱基置换 TA102 如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。

45 一、常用的致突变试验 （二）微核试验(micronucleus test，MNT）
不能进入子代细胞的细胞核中 断片 缺失 在间期的子代细胞浆内形成一个或几个规则的次核，因比主核小，故称微核。 因纺锤体受损伤而 丢失的整个染色体 微核试验：通过观察有微核的细胞率（‰），用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。

46 一、常用的致突变试验 （二）微核试验(micronucleus test，MNT） 应用最多的是： 啮齿类动物骨髓多染红细胞（PCE）
植物细胞（蚕豆根尖） 可用作微核检测的细胞 哺乳动物细胞（骨髓细胞、肝细胞等） 非哺乳动物细胞（鱼红细胞等） 应用最多的是： 啮齿类动物骨髓多染红细胞（PCE）

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49 MN NCE

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53 （三）微核试验(micronucleus test，MNT）
1. 动物选择：大、小鼠，以小鼠最为广泛，刚成年，20g左右，每组10只，♀♂各半。 2. 染毒途径：经口、经皮、经呼吸道及注射等。 3. 染毒次数及取样时间：不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间不尽相同，在24~72h波动。建议采用多次染毒的方法。其中以４次染毒比较方便合理，即每天染毒一次，连续4天，第5天取样。也可采用30h两次给药法，即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h取材。 ４. 剂量选择和分组：至少两个处理组（高：LD50/7的80%，低： LD50/7的40%），阳性对照组（环磷酰胺），阴性对照组

54 （三）微核试验(micronucleus test，MNT）
5. 骨髓液的制备和涂片： 6. 固定：甲醇溶液固定 7. 染色：Giemsa应用液染色 ８. 观察计数：计数1000个PCE中含微核的PCE数,并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 如果试验组微核细胞率显著高于阴性对照组；并有剂量反应关系，即可认为受试物对该试验动物的骨髓细胞染色体有损伤作用。

55 MN NCE

56 (四)小鼠精子畸形分析和睾丸染色体畸变分析 精子形态受基因控制，受常染色体、X、Y性染色体决定。
本实验可检测环境因子在体内对生殖细胞的致突变作用。 小鼠睾丸染色体畸变试验 检测环境有害物质对整体哺乳动物睾丸生殖细胞染色体的损伤。 染色体形态结构和数目的改变，又称细胞遗传学试验。

57 一、常用的致突变试验 （三）哺乳动物细胞基因突变试验 正向突变：野生型基因失活的突变 特定基因座 小鼠淋巴瘤细胞系(L5178)
中国仓鼠肺(V97)细胞株 中国仓鼠卵巢细胞(AS52)细胞株 常用的基因座是hprt(Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶）、Tk(thymidine kinase ，胸腺激酶）和gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)

58 （二）哺乳动物细胞基因突变试验 原理： hprt ， tk及gpt编码的产物可催化相应核苷的磷酸化反应，生成相应的核苷单磷酸。这些磷酸化产物可掺人DNA中，引起细胞死亡。核苷类似物(如5-溴脱氧尿嘧啶核苷，三氟胸苷及6-硫代鸟嘌呤等)也可作为其底物被磷酸化，可通过观察在含核苷类似物的选择培养液中细胞集落形成数量，检测受试物的致突变性。

59 选用成年动物，每周更换一批新的雌鼠与染毒雄鼠交配，根据不同周次交配的雌鼠发生胚胎显性致死可判断受试物遗传毒性作用于精子的发育阶段。
(五)显性致死试验 选用成年动物，每周更换一批新的雌鼠与染毒雄鼠交配，根据不同周次交配的雌鼠发生胚胎显性致死可判断受试物遗传毒性作用于精子的发育阶段。

60 化学毒物致突变作用的 研究方法 二、致突变试验中的一些问题 （一）体外活化系统
在体外致突变试验中，为了检测直接及间接诱变剂，一般应分别在加及不加代谢活化系统的条件下进行试验。在试验中加入的代谢活化系统。 1.无细胞系统：一般是S9混合液； 2.哺乳动物细胞； 3.宿主介导细胞。

61 （二）阳性和阴性对照组的设立 设立阴性对照组的目的： 获得试验的基础数据。 设立阳性对照组的目的： 1.证明实验方法的可靠； 2.验证试验的重复性； 3.鉴定致突变物的能力。

62 （三）致突变试验与致癌试验的关系 致突变作用是致癌作用机制之一。致突变试验在鉴定潜在致癌物和揭示致癌作用机制上意义：
1、发现人类接触致癌物与DNA加合物、肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性; 2、大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用； 3致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物；发展短期快速试验 4、致癌物检测方法：短期试验、哺乳动物诱癌试验和人类流行病学观察。致突变试验时短期试验一类，需与其他试验结合，以获得可靠结论。

63 （四）试验结果在毒理学安全性评价中的作用
１.阳性：应综合分析试验组的效应比阴性对照组是否明显增加、是否具有剂量-反应关系、对于弱的或可疑的效应结果是否具有可重复性等。 ２.还应对试验的条件进行分析。 体外阳性结果 代谢活化系统？ 过高或过低的pH、渗透压、严重的沉淀等？ 是否仅在细胞生存率很低的情况下发生？ 阴性结果 体外：代谢活化系统对于受试物是否适用和充足 体内：允许最大剂量；剂量组间差异下。

64 致突变试验结果判断： １、任一试验中呈现阳性，即可确定具有致突变性； 2、在检测五种遗传学终点的一系列试验中，均为阴性，可确定为非致突变物；
3、几个测试系统阳性，除非有令人信服的证据。