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PCR引物设计及相关软件使用
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主要内容 PCR介绍 引物设计原理 引物设计的优化原则 Primer Premier 5.0 介绍 举例说明引物的设计
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PCR介绍 1、什么是PCR 2、PCR的组成 3、如何提高PCR成功率 （定量，对照）
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引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。
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引物设计的原则 1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物。有人用20～23个核苷酸引物得到40 kb的产物。
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引物设计的原则 2、引物GC含量 GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热。
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引物设计的原则 3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G)
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引物设计的原则 4、引物3’端 引物3’末端和模板的碱基完全配对 防止一对引物内的同源性 考虑末端5个碱基的ΔG
引物3′端要避开密码子的第3位
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引物设计的原则 5、引物序列与模板序列组成的相似性 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高 。
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引物设计的原则 6、最好在模板cDNA的保守区内设计
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
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引物设计的原则 7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列
7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
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引物设计的原则 8、碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
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引物设计的原则 9、引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
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引物设计的原则 10、ΔG值 ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
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引物设计的原则 11、引物的5′端 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
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引物设计的原则 12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物
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Primer Premier 5.0 简介 主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找
4、同源性分析
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Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence Preimer Premier 启动界面
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基本信息 Sequence name Original sequence Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
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引物设计界面 First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand Useful information of the primer
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引物搜索选项设定 引物类型 引物长度 搜索模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围
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搜索结果 28对引物 每对引物的信息 引物分值 100分为满分 双击选中一对引物
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是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer
引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer
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一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有
But …
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引物编辑
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引物编辑 Edit primer here Analysis the edit result
Accept the edit result Return to the main window
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举例说明 任务 用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1
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Plasmid 1: BamHI NR1 SP pcDNA3.1 Plasmid 2 GFP
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GFP BamHI(GGATCC) NR1-1a SP pcDNA3.1
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NR1的编码序列(~4000bp) 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa 红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框
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GFP序列(~700bp) ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAA
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引物要求 PCR扩增GFP GFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变
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第一步：扩增GFP基本序列 GFP序列 变性, 引物复性
5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’ 变性, 引物复性 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ ………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’ Primer2 Primer1: 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………… 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’ Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. Primer2: 5’ TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA……. Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….
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第二步：GC比值；Tm值 Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..
Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA……. Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64） Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）
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第三步：酶切位点 BamHI: ggatcc Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）
Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66） Primer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
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第四步：阅读框 NR1序列： atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc
cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct….. Primer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
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5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’
NR1序列： atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct GFP序列 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 插入GFP后的组合序列 cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ………………………… …TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ??ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct
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Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
Primer2: 5’ gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC
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第五步 保护序列 Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’
第五步 保护序列 Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
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