6.高效液相色谱仪的测定原理及基本构造.

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1 6.高效液相色谱仪的测定原理及基本构造

2 2． 了解并掌握高效液相色谱仪（HP1100）的基本构造。
一．      实验目的： 1．   学习高效液相色谱法的测定原理； 2．   了解并掌握高效液相色谱仪（HP1100）的基本构造。

3 二．      实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似，流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色谱法和气相色谱的缺点。

4 它使用了多孔微粒固定相，装填在小口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。由于80%的有机化合物都可以用高效液相色谱法分析，目前已经广泛应用于生物工程、制药工业、食品工业、环境检测、石油化工等行业。

5 在液相色谱中，分离有机化合物，一般情况下用直接与标准物对照的方法，根据保留时间（t0）的不同进行化合物的定性分析。
根据使用的固定相及流动相的极性不同，分为正相液相色谱和反相液相色谱：固定相为极性，流动相为非极性的液相色谱色谱称为正相液相色谱（固定相为硅胶和氧化镁，流动相为正己烷，醚等）；固定相为非极性，流动相为极性的液相色谱色谱称为反相液相色谱（固定相为碳粒和氧化铝，流动相为水、醇等） 在液相色谱中，分离有机化合物，一般情况下用直接与标准物对照的方法，根据保留时间（t0）的不同进行化合物的定性分析。

6 当未知峰的保留值与某一已知标准物完全相同，则能判定未知峰可能与已知标准物为同一物质，特别是如果色谱柱条件改变，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能一致，则基本判定是同一物质；
定性分析后，用峰面积进行定量分析。标准物配成不同的标准，测定峰面积，作浓度和峰面积的标准曲线，然后据未知物的峰面积，在曲线上求浓度。

7 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法　使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

8 2．液液色谱法　使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

9 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

10 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法　采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。                     反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

11 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

12 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出
正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出

13 3．离子交换色谱法　固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

14 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

15 4．离子对色谱法　又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

16 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

17 5．排阻色谱法　固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

18 四．      仪器结构： 1．   流动相及储液罐：储液罐用耐腐蚀材料（玻璃、不锈钢、氟材料等）；流动相为液体（正相液相色谱常用：乙醚，氯仿，三氯甲烷等作溶剂；反相液相色谱常用：甲醇，乙腈，四氢呋喃和水作溶剂），使用前必须进行脱气，防止气泡产生干扰。 2．    高压输液泵：耐压1-400bar(40-50Mpa)，在分析过程中，色谱柱装填5-10微米的固定相，对流动相有很高的阻力，必须在高压条件下才能完成流动相及测试样的穿透。

19 4． 色谱柱：为不锈钢柱，内有充填物，HP1100为C18柱，辅助有柱温相装置，平衡流动相和室温，减小误差。
3．     进样装置：通常有自动进样、六通阀进样。 4．     色谱柱：为不锈钢柱，内有充填物，HP1100为C18柱，辅助有柱温相装置，平衡流动相和室温，减小误差。 5．  检测器：常用的有紫外吸收检测器（UVD），折光指数检测器（RID），电导检测器（ECD），荧光检测器（FD）。

20 折光指数检测器（RID），电导检测器（ECD）分别测定柱后流出液的总体折射率和电导率，测定灵敏度低，易受流量和温度的影响，造成较大的漂移和噪声，不适合痕量分析。
紫外吸收检测器（UVD）和荧光检测器（FD）分别测量溶质对紫外光的吸收和溶质在紫外光的照射下的荧光强度，检测灵敏度高，不易受流量和温度的影响，但不能用于测定对紫外光有吸收的流动相，适合痕量分析。

21 四．      问题讨论 1．    HP1100的C18柱反相液相色谱仪，解释一下通常用来分离什么物质？ 2．    紫外检测器有何优点？ 用框架图画出HP1100液相色谱仪的构造流程 ,解释各部分的功能.