Denaturation of DNA Causes Hyperchromism

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1 Denaturation of DNA Causes Hyperchromism
1.3 1.2 1.1 1.0 Relative absorbance (260 nm) Tm Adapted from Voet et al (1999) Fundamental of Biochemistry p.739 若把 DNA 逐漸加溫，分子間的活動力越來越大，也越難維持兩股間的吸引力，當到達某一溫度後，兩股一下子分開來，期間的鹼基對全部外露，會增加此 DNA 對紫外光的吸收能力，稱為 hyperchromic effect。其實兩股 DNA 間的吸引力還算相當強，因此不到一定溫度，兩股不會散開來。而每一種 DNA 兩股間吸引力大小不同，各有其特定的解開溫度，稱為 Tm (melting temperature)，是每種 DNA 的特有性質。 Temperature (C)

2 G+C Content Is Proportional to Tm
1.4 1.2 1.0 Pneumococcus (38%) G+C E. coli (52%) S. Marcescens (58%) Relative absorbance (260 nm) M. Phlei (66%) Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.372 為何 每種 DNA 的 Tm 都不一定相同？ 因為兩股間吸引力大的，其 Tm 會比較高；而兩股間的吸引力為何有大小之別？ 那是因為兩種鹼基對中，AT 之間只有兩個氫鍵，而 CG 間有三個氫鍵，因此 GC 含量越多的 DNA，Tm 就越大。 Temperature (C)

3 Cation Neutralizes Phosphate and Elevates Tm
100 80 60 40 20 0.01 M phosphate 0.001 M EDTA 3’ 5’ G + C (%) 0.15 M NaCl 0.015 M Na citrate 除了 GC 含量會影響 Tm 外，溶液中的離子濃度也有很大影響。 若溶液的離子濃度低，則 DNA 的 Tm 也會降低；因離子可中和兩股 DNA 分子上的強大負電基團 (磷酸)，若離子濃度太低，則兩股磷酸負電無法有效中和，因而造成互斥致使 Tm 下降。因此，請注意在做實驗時，不要把 DNA 溶在純水中，沒有離子的中和，兩股 DNA 可能會互斥，造成變性而沈澱。RNA 則無此問題，為什麼？ Tm (C) Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.372

4 G+C Content Is Proportional to DNA Density
80 60 40 20 Pneumococcus E. coli Serratia M. phlei Salmon sperm Calf thymus G + C (%) Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.375 GC 成份高會使得兩股之間的吸引力增高，因此 DNA 分子密度會顯得比較高。另外，由上圖可發現各種生物的 DNA 中，所含的 GC 成份可能相差很大，有低至 40%，也有高至 60% 以上。有一大類古生菌，專門生長在溫泉地區，生活環境的溫度很高，請預測這種生物的核酸當中，GC 的百分比應該如何？ Density (r)

5 Renaturation Time Is Proportional to Complexity
Genome size K 10K 0.5 1.0 Poly U/ Poly A Mouse satellite MS2 T4 E. coli Calf Fraction reassociated 若 把各種生物的基因體取出，經變性分開兩股後，再慢慢降溫復性，則可發現各種生物復性所需要的時間不同；可以預測越複雜的基因，其復性時間越長，上圖結果的確支持此一想法。圖中的 C0t 代表測試核酸的濃度 (C0) 與復性所需時間 (t) 的乘積，通常若核酸濃度固定，則只需考慮時間，因此橫座標就直接看成時間。每一條曲線，由左上到右下方看，顯示復性的比例越來越多 (1.0 代表全部都復性成功)，而以其中點 (0.5) 作為測量的根據。 c0t (mole/L • sec) Time for renaturaton (Longer) Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.374