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微小RNA及其在医学中的应用
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一、微小RNA的发现 人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2％。其它98％的基因组有什么功能呢？约24％为内含子序列，这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？
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后基因组时代的中心法则 基因组的保持 DNA 修复和重组 基因组的表达 RNA 加工 基因调节
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后基因组时代的基因调控：RNA 调控
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人类基因组绝大部分被转录成RNA 非编码RNA的数量是编码RNA的数百倍 生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内，而非编码序列内。
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2006年的诺贝尔生理学奖获得者： Andrew Z. Fire Craig C. Mello
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微小RNA（microRNA, miRNA）的发现
Victor Ambros Gary Ruvkun 第一个被发现的miRNA (lin-4)由哈佛大学的Victor Ambros 发现的（1993） 第二个被发现的miRNA（let-7）由哈佛大学的博士后Frank Slack (Ruvkun 实验室）发现的（2000)
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第一个被发现的miRNA: lin-4 Ruvkun G, Wightman B, Ha I. The 20 years it took to recognize the importance of tiny RNAs. Cell Jan 23;116 (2 Suppl):S93-6. Lee R, Feinbaum R, Ambros V. A short history of a short RNA. Cell Jan 23;116 (2 Suppl):S89-92
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近年来被鉴定的miRNAs越来越多 至今超过17000 miRNAs已被发现
可以免费获得
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二、微小RNA的特点
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微小RNA的作用特点 主要是在蛋白质水平调控
５’端２-８个核苷酸高度保守，主要作用在靶mRNA的３’端非翻译区（unstranslated region, UTR） 分完全和不完全配对两种方式，哺乳动物主要为不完全配对结合，影响mRNA的成熟、转运、稳定性或者在直接调控翻译 是翻译抑制还是剪切mRNA，除配对因素外，还取决于RISC中组装元件的功能，如Arg蛋白
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小干扰RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA的异同点
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siRNA和miRNA的相同点 相同点 siRNA miRNA 长度 22nt左右 合成的底物 由双链RNA或RNA前体形成的 Dicer酶
Argonaute家族 需要Argonaute家族蛋白参与 蛋白RISC组分 都是RISC组分，其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠 作用方式 在转录水平后和翻译水平起作用
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不同点 siRNA miRNA 机制性质 外源引起，如病毒感染诱导产生，异常情况 生物体自身的正常调控机制 直接来源 长链双链RNA 发夹miRNA前体 分子结构 双链RNA 单链RNA 对靶RNA特异性 较高 相对较低 互补性 一般要求完全互补 不完全互补，存在错配现象 生物学功能 抵抗病毒感染； 沉默过分表达的mRNA； 保护基因组免受转座子的破坏 对机体生长发育，神经分化，脂类代谢，细胞增殖分化，肿瘤发生有重要作用
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三、微小RNA的主要功能 疾病 发育 增殖 (干细胞) miRNA 分化 凋亡
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1. 调控发育过程 Victor R. Ambros 秀丽线虫 C. elegans
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miRNA的表达具有组织特异性 斑马鱼 青鳉 小鼠 果蝇 miR-124a局限表达于神经组织 miR-1局限表达于骨骼肌和心肌
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2. 调控细胞分化 3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程 ( Science 2004)
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3. miRNAs与心血管疾病 （调控心肌前体细胞 的增殖）
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4、miRNA 与病毒感染 microRNA 禽流感病毒 HBV,HCV 逆转录病毒家族 多瘤病毒家族 host or virus
Avian influenza virus 疱疹病毒家族 EBV,KSHV,MHV-68, HCMV,HSV-1 HBV,HCV 逆转录病毒家族 HIV-1 多瘤病毒家族 SV40(Simian virus 40) 腺病毒家族 hAV(adenovir)
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miRNA与肝炎病毒 诊断、治疗 HBV ≠ ≠ ≠ ≠ 基因表达 信号传导 肝细胞肝癌发生、发展 miRNA HCV
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在肝炎模型中发现的肿瘤相关miRNA HBV HCV has-let-7a ras and c-myc genes has-miR-34
p53 tumor supressor pathway has-miR-191 Worse survival in acute myeloid leukemia HBV has-miR-133b Sequamous cell carcinoma has-miR-142-5p Hematopoietic specific HCV Normal
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5.微小RNA与肿瘤的关系
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微小RNA调控癌基因表达
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下调miRNA表达，促进了E2F1的表达 NorternBlotting Western Blotting
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有些微小RNA可能是致癌基因 mir-17–92高表达
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增加mir-17–19b的表达，加速了c-myc诱导的淋巴瘤形成
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miRNAs与肿瘤的关系
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miRNA与疾病关系的研究策略 诊断 哪些重要的miRNA影响到 某种生命活动 治疗 miRNA在什么时候、 在哪里表达
的靶基因 哪些miRNA表达 分离,克隆,测序 功能分析 哪些重要的miRNA影响到 某种生命活动 治疗 miRNA文库筛选
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四、微小RNA与胃癌的关系 (一)胃癌概述 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。 中老年发病较多，男女比例约2比1
全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。
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(二)目前胃癌诊治的现状 早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。
进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约1年。胃癌5年总生存率一般在10%左右。 胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移 肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物
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(三)技术路线 临床研究 体外实验 功能分析 定量RT-PCR miRNA芯片 胃癌组织 癌旁组织 总 RNA 提取
胃癌组织 癌旁组织 (三)技术路线 临床研究 体外实验 功能分析 总 RNA 提取 miRNA芯片 定量RT-PCR 组织类型 细胞分化 侵润深度 TNM分期 转移 细胞培养, MGC803, SGC-7901 反义寡核苷酸阻断miRNA的表达 生长曲线MTT 定量PCR检测 细胞周期 凋亡检测 靶基因分析 综合分析确定miRNAs可能的致癌机制
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(四)胃癌组织中微小RNA的表达谱 芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNA 19种差异表达的微小RNA 12 7
12 miR-139-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现 miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达 Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4):
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(五)临床病理因素分析结果 高表达的微小RNA（miR-106a）与胃癌分期的关系
Xiao B, Guo J, et al. Clin Chim Acta. 2009;400(1-2):
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miR-106a异常表达的临床意义 因素 病例数 变化倍数 P 直径 ≥5cm 30 68.59 258.49 <0.001
分化 中 <0.001 低 淋巴结转移 <0.001 20.52 远处转移 <0.001 侵润 T 0.04 T <0.001† T =0.005‡ T
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实时定量PCR 结果 癌组织中mir-421的表达明显高于癌旁组织
Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI /S
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体外实验结果 合成特异性微小RNA引物、用未转染肿瘤细胞中的对照，比较转染后癌细胞中微小RNA表达的变化
蒋振，郭俊明，等. 中国病理生理杂志 2009, 25(9):
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下调miR-421表达对胃癌细胞生长的影响 Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI /S
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miR-421靶蛋白实验结果 筛选微小RNA匹配度最高的肿瘤相关靶基因、检测靶基因在蛋白质水平上的变化
Jiang C, Guo J，et al. Journal of Gastroenterology. DOI /S
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肿瘤抑制基因Rb和PTEN 分别受到miR-106和miR-21的调控; E2F1受到miR-17-92基因簇调控
胃癌相关微小RNA的功能研究 肿瘤抑制基因Rb和PTEN 分别受到miR-106和miR-21的调控; E2F1受到miR-17-92基因簇调控 癌旁 癌 Rb PTEN E2F1 免疫组化 Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4):
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结 论 实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调miR-421的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可能是一个潜在的胃癌治疗靶点
结 论 实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调miR-421的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可能是一个潜在的胃癌治疗靶点 miR-421发生的初期阶段中可能起重要作用,它可能是一个新的胃癌诊断候选标志物 通过临床病例检测， miR-421在肿瘤病人中阳性率为73.33%，阳性率较高优于现在临床胃癌标志物CEA检出灵敏度（仅40%）
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