第四节 细胞培养技术.

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1 第四节 细胞培养技术

2 一、体外细胞培养技术 细胞培养（cell culture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。 优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变

3 IN VITRO:（离体的，即在玻璃容器中）用培养细
胞进行的实验 IN VIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验 生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫IN VITRO，在活细胞内发生的生化反应叫IN VIVO

4 原代培养（primary culture）：
直接取材于有机体组织的细胞进行培养 传代培养（secondary culture）： 把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养 细胞体外培养所需的一般条件： 适宜的培养皿 血清成分 37℃ 5％CO2 95～100％湿度 抗生素

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6 细胞系（cell line）： 在细胞培养中产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞可被无限的传代。 常见的细胞系： NIH3T3细胞系：1963年取自小鼠胚胎细胞建立 Hela细胞系：1952年取自人宫颈癌细胞建立

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8 二、细 胞 融 合 技 术

9 （一）、细胞融合（cell fusion）：是指
将两个或两个以上的细胞合并形成一个细 胞的过程。

10 异核体： 将两个不同类型的细胞融合，可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能，这种细胞叫异核体。常用灭活的仙台病毒或聚乙二醇（PEG）人工促使融合。异核体进行有丝分裂则可产生杂种细胞。

11 （二）、单克隆抗体技术 B淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变为浆细胞产生抗体。每一个B淋巴细胞只能接受单一的抗原刺激产生特异性抗体,从单个B淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫 单克隆抗体(monoclonal antibody) 。

12 B淋巴细胞不能在体外无限增殖,故1975年kÖehler和Milstein利用杂交瘤技术,使绵羊红细胞(SRBC)免疫后小鼠的B淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合,建立产生抗SRBC单抗的杂交细胞株。它既具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力,又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点,可不断在细胞培养上清液中产生单抗。

13 B淋巴细胞可产生抗体但在体外不易存活，小鼠骨髓瘤细胞可在体外培养生存并无限增殖。将小鼠骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的B淋巴细胞融合，这种融合细胞即具有肿瘤细胞无限增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异抗体的能力，称为杂交瘤细胞。

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16 不到有效剂量 2、鼠源性抗体异质性 3、半衰期短,只有5～6小时 4、肿瘤细胞抗原性调变,抗体分子不能有 效地与肿瘤抗原结合,使效价下降
单克隆抗体在应用上的局限原因 1、完整Ig分子量大,难以穿透肿瘤组织,达 不到有效剂量 2、鼠源性抗体异质性 3、半衰期短,只有5～6小时 4、肿瘤细胞抗原性调变,抗体分子不能有 效地与肿瘤抗原结合,使效价下降

17 第五节 细胞分子生物学研究方法

18 DNA复性:当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。
一、原位分子杂交技术 DNA变性:当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下,维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离成两条单链,这一过程叫DNA变性。 DNA复性:当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。

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21 核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。

22 原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序
在其原位进行杂交,叫原位杂交。可 用于DNA、RNA定位研究。

23 荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization,FISH）

24 二、聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）
又叫体外基因扩增技 术。利用人工合成的 一对引物，在被扩增 DNA模板链的两端形成 双链，由DNA聚合酶催 化一对引物之间的聚合 反应。

25 ① 变性：将双链DNA加热（95℃）使 之变性，DNA双链变成单链 ② 退火：降低温度至56℃使引物与 模板DNA单链结合
具体过程： ① 变性：将双链DNA加热（95℃）使 之变性，DNA双链变成单链 ② 退火：降低温度至56℃使引物与 模板DNA单链结合 ③ 延伸：将温度升至72℃，在DNA聚 合酶作用下，在引物3’端 进行延伸，使原模板DNA的 一条链变成两条链。

26 三、反义核酸技术 主要是引入mRNA的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通过它们的杂交阻遏或降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与相应序列配对后 ，用于表达目的基因的mRNA量大大减少，使细 胞中靶基因编码的蛋白 合成量也大为减少

27 反义技术的应用： ① 基因功能的研究 ② 病毒基因组功能的研究 ③ 作为药物 ④ 抗肿瘤作用

28 四、基因转移技术 将外源基因转移到受体菌或细胞内使之在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术。它是重组DNA、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一。 方式： 转化 转染

29 转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具，随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。

30 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

31 影响转染效率的主要因素有： 1、细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前24小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。

32 2、血清     大多数培养基在使用前需要加血清。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。

33 3、载体构建 转染载体的构建也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成及合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因相同载体构建的正对照可排除毒性影响的干扰。

34 4、DNA质量 DNA质量对转染效率影响非常大。如果DNA不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

35 5、转染技术   转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

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37 五、基因敲除与敲进 基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。

38 基因敲进（knock in of gene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。

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40 ④ 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物
意义： ① 研究基因功能 ② 转基因动物的制备 ③ 用于药物筛选的动物模型 ④ 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物