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免疫印迹技术ENA测定.

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1 免疫印迹技术ENA测定

2 自身抗体的检测方法 免疫荧光法 (Immunfluorescence Assay, IFA) 酶联免疫吸附法
(Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA) 免疫印迹法 (Western-blot, WB) 放射免疫法 (Radioimmunoassay,RIA) 对流免疫电泳及免疫双扩散法

3 间接免疫荧光法(IFT)

4 ELISA: ENA谱

5 条带印迹法: ENA谱

6 条带印迹法: ENA谱

7 免疫印迹法 SDS-PAGE电泳 转移电泳 酶免疫检测

8 免疫斑点法(Immunospot) 纯化可提取性细胞核抗原(ENA)包被于硝酸纤维膜上,待测血清标本与之反应,如存在相应抗体,则会结合上去,并进一步结合酶标记的二抗,经酶底物显色即可观察到相应的抗体。

9 试剂 样本稀释液:直接使用 工作洗涤液:试剂盒内浓缩洗涤液用蒸馏水作1:10稀释. 酶标记二抗:直接使用 底物:直接使用

10 操作步骤 润膜:取出反应槽,每槽加入1.5ml样本稀释液,缓慢于室温孵育5分钟,将膜条充分润湿。

11 操作步骤 加酶:每槽加入样本稀释液1.5ml,酶标抗体150μl,混匀,缓慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤:同前洗涤。
终止:每槽弃去反应液,用蒸馏水洗涤三次,取出膜条,有序贴于结果分析页上,待膜条干后进行结果判断。

12 影响因素 未用完的洗涤液弃之,不可留作下次用。 全部操作需放在摇床器上进行,否则检测敏感性会有所下降。
不同血清标本,显色强度会有不同,弱阳性结果需仔细观察。 试剂需恢复至室温方可使用,否则会影响检测结果。 该方法不受胆红素(<0.4mg/ml),溶血(血红蛋白<5mg/ml),脂血(甘油三脂<20mg/ml)干扰。

13 试验准备 分为4组,每组取2个病人标本,1个阳性质控,在一个反应板上试验。 提供8份不同血清标本,每组2份。

14 各组需领取以下物资: 待测标本2份 阳性质控1份 反应板和吸水纸 样本稀释液1瓶 已配制好的洗涤液1瓶 二抗1支 显色液1瓶

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16 结果解释 首先观察第一条质控线应显色才可判读结果,若不显色则说明试剂失效或实验失败,需复查。
将膜条上显色区带与抗体位置对应抗体带对照,即可判断出阳性抗体.

17 抗可提取性核抗原(ENA)抗体 抗Sm抗体:SLE标记性抗体(20%-30%) 抗nRNP抗体:MCTD 95 -100%(高滴度)
抗SSA抗体:PSS %,其它CTD 抗SSB抗体: PSS %,其它CTD 抗Scl-70抗体:SSc %, 标记性抗体 抗Jo-1抗体:PM/DM 25%,标记性抗体 抗rib抗体: SLE特异性抗体(10%-30%) 抗RO52抗体:不报告临床


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