programmed cell death, PCD

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1 programmed cell death, PCD
细胞凋亡 Apoptosis programmed cell death, PCD 徐霞 细胞凋亡（apoptosis）是由基因调控的主动而有序的细胞死亡，又称程序性细胞死亡（programmed cell death ,PCD）。 1. 维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡：清除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。 2. 在胚胎发育中起重要作用：  手指和脚趾的形成等。  大脑神经元之间形成连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。  蝌蚪的尾巴可在甲状腺素的作用下消失。 在淋巴细胞发育成熟中起重要作用。 心脏发育过程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋亡调节。 3. 细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病。

2 凋亡细胞的形态学和生化特征： 细胞皱缩 质膜出泡 染色质浓缩 DNA裂解：DNA ladder 磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧 凋亡小体的释放

3 核酸内切酶活化与DNA片段化是凋亡的生物化学标志。
DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体，当核酸内切酶在核小体连接部切开DNA时，即可形成180～ 200bp或其整倍数的DNA片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征的阶梯状（ladder）条带，是判断细胞凋亡的客观指标之一。

4 DNA ladder DNA 180bp endonucleolytic DNA fragmentation nucleosome
core histone DNA 180bp chromatin

5 细胞凋亡过程（四个阶段）： 1. 凋亡信号转导 2. 凋亡基因激活 3. 凋亡的执行（由DNase 和caspases执行） 4. 凋亡细胞的清除。

6 细胞凋亡信号的转导 凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序 细胞凋亡（DNA片段化及蛋白解体等）。
凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序 细胞凋亡（DNA片段化及蛋白解体等）。 细胞凋亡主要有三条通路： 外源性通路（死亡受体途径） Fas, TNF… 内源性通路（线粒体途径） 内质网通路

7 细胞凋亡的三条通路 紫外线等 （如FasL）→（如Fas）→FADD→Caspase-8→凋亡酶体 ↓ ↓
死亡配体 死亡受体 紫外线等 （如FasL）→（如Fas）→FADD→Caspase-8→凋亡酶体 ↓ ↓ DNA损伤 线粒体→Cytc→Apaf-1→Caspase-9→Caspase-3、6、7- P53↑ ↓ ↓ 底物 Bax↑、Bcl-2↓ ↓ 神经酰胺 细胞凋亡 内质网中Ca离子过多 未折叠的蛋白质积累→ →Bax/Bak→ → caspase-12

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9 半胱天冬酶（胱冬酶，Caspase，Cysteine-containing aspartate-spicific protease）
N· · · · A-B-C-D-Asp-X · · · ·C 不同的Caspase对ABCD种类要求不同。

10 Caspase的分类 （1）上游/启动型caspase: 2、8、9、10、12等 （2）下游/执行型caspase: 3、 6 、7等

11 Caspase的底物 细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白→染色质聚集浓缩。
100多种 细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白→染色质聚集浓缩。 与DNA损伤修复相关的蛋白质和酶，阻止DNA损伤的修复。如：DNA依赖性蛋白激酶、DNA复制相关蛋白、聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）。 激活DNA酶，促进DNA断裂等。

12 Caspase的作用 在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器”。
Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信号传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。但并非所有的凋亡过程都有caspase的参与。

13 细胞凋亡实验 Hela细胞培养至70-80% 接合，加30μL 大蒜素，培养2hr. ↓
去除培养液，加PBS 500μL，细胞刮刀刮出细胞吸至EP管， 再用PBS 500μL洗平皿，2000rpm离心2min，弃上清. PBS洗1遍，离心收集细胞（2管） DNA Ladder Caspase-3活性检测 1管 1管

14 DNA Ladder 细胞沉淀中加入200微升PBS，轻轻吹散或弹散细胞，使细胞重悬于PBS中。 ↓
加入4微升RNase A，Vortex混匀。室温放置2分钟 加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀 加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟 （加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合） 加入200微升无水乙醇，Vortex混匀 （加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内） 把上述混合物加入到DNA纯化柱内，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 加入500微升洗涤液I，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 加入600微升洗涤液II，12000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 12000rpm离心1分钟，以去除残留乙醇 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50μL洗脱液。室温放置3分钟。 12000rpm离心1分钟，所得液体即为纯化得到的总DNA。 （洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收）

15 琼脂糖凝胶电泳 将抽提得到的DNA 50μL+10Loading buffer 6μL，混匀，上样进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。电压60V，时间3-4hr，观察DNA ladder的形成。

16 细胞沉淀加入50微升裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟
Caspase-3活性检测 细胞沉淀加入50微升裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟 ↓ 12,000g离心15分钟 把上清转移到预冷的离心管中 立即测定caspase 3的酶活性。同时取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度 设置反应体系： 空白对照管 样品管 检测缓冲液 90μl 50μl 待测样品 0μl 40μl Ac-DEVD-pNA (2mM) 10μl 总体积 100μl ↓ 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育2hr。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间 计算caspase 3的酶活力单位

17 空白对照 样品 PBS 20μl 17μl 待测细胞裂解液 0μl 3μl G250染色液 200μl Bradford法测定样品蛋白浓度
室温放置5min 酶标仪测定样品的A570-空白对照的A570 (y) 根据公式计算样品蛋白浓度：y=0.0006x

18 样品中caspase 3催化生成的pNA的吸光度（y）=样品的A405-空白对照的A405
↓ 通过标准曲线公式：y=0.0025x ，求出样品中催化产生的pNA的量。 样品单位重量蛋白中所含caspase 3的酶活力单位 = 样品中酶催化产生pNA的量 / 待测样品蛋白浓度

19 预试结果：DNA Ladder

20 预试结果：caspase3标准曲线 A 0.033 0.061 0.14 0.274 0.499 C 10 20 50 100 200

21 蛋白浓度测定标准曲线