细胞凋亡 陈莉 南通大学基础医学院.

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1 细胞凋亡 陈莉 南通大学基础医学院

2 Cellular Apoptosis 细胞凋亡 一、概论
随着生物学研究的深入，生物学家越来越意识到细胞死亡，特别是细胞凋亡具有特殊的生物学意义，对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。

3 细胞死亡是组织病理学的中心议题，细胞死亡现象也是生命新陈代谢的固有本质。例如胚胎发育(embryonic development)正常组织更新（Normal tissue turnover），以及在增殖淋巴细胞群体中选择适当的克隆（selection of appropriate clones ），这种细胞生理性死亡是种系发育史中早就存在的，有利于动物发育中的许多生命功能。

4 1972年Keer根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念。
80年代末，细胞凋亡成为新的医学研究热点。 正是由于发现了细胞凋亡的规律，三位科学家获得了2002年的诺贝尔医学或生理学奖。他们是英国的西德尼•布伦纳、美国的 H•罗伯特•霍维茨和英国的约翰• E•苏尔斯顿。

5 二、凋亡概念： 细胞凋亡是细胞循自身程序结束其生命的主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。即是由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。

6             三、 凋亡的形态特征 凋亡发生的过程表现为细胞死亡（dying process）和被清除(elimination process) （细胞缩小→致密染色质边集→核碎片→凋亡小体） 1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来； 2、细胞缩小：①胞浆细胞器集中（squeeze） ②胞膜出芽或起泡（bleb） ③细胞皱缩（shrinkage）；

7 3、保持胞浆细胞器完整性 扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，①线粒体不肿胀，内膜不破裂；②短暂滑面内质网（SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；③有时有聚积排例的半结晶状核糖体；④可有与细胞表面平行的微丝束。 4、形成调亡小体（Apoptotic bodies） 由凋亡细胞裂解为若干个由质膜包绕的小体，每个凋亡小体有自己的一簇细胞器。周围不引起炎症反应。

8 5、核内染色质结构改变（这是最引人注意的改变）
染色质（chromatin）凝集于核膜下表现为： ①核质固缩（condenation）； ②边集（margination）； ③核浆紧实（compaction）； ④核膜皱折（fold）。

9 HE×1000，小鼠凋亡肝细胞

10 HE×1000，小鼠凋亡肝细胞

11 在透射电镜下，染色质浓缩在一起呈颗粒状，半月形磨茹，或完整的捻珠形；核孔集中于少数区域，浓缩的染色质并不贴附在核膜上；转录复合物从核仁中脱落到核浆中呈一簇嗜锇酸小体。残留的核仁蛋白核心移到周围染色质特征性部位。核扭曲，断裂呈若干片断，所有片断开始时均有质膜包绕。

12 6、凋亡细胞、凋亡小体被识别与吞噬： 凋亡细胞或凋亡小体迅速被吞噬 同质或异质细胞 吞噬体（phagosome） 进一步变性
溶酶体残留小体（lysosomal residual bodies） 偶尔凋亡小体逃避被吞噬，如凋亡的导管上皮掉入管腔。

13 几点说明： 1、形态学改变告诉我们凋亡细胞发生早期细胞体积缩小（<50%）密度增加，胞浆细胞器保留完整，说明细胞是有选择性的丧失了水和电解质，而较致密的结构成分得以保留下来，这种水分的迅速输出可能在内质网，使之在与细胞表面融合前呈短暂性扩张。

14 2. 胞浆胞核冒泡的机制还不十分清楚，Fesus发现在这个时相中，转谷氨酰胺酶（trangluamirase）活性可在受损细胞中检测到，转谷氨酰胺酶是交联蛋白酶，能使蛋白质成为不溶解的，具有高度化学上变质的一种化学剂，在凋亡细胞膜下构成一层由转谷氨酰胺酶化的蛋白质僵硬壳，这就很容易引起某些细胞的形态改变，并与凋亡细胞体积缩小和不溶解性有关。

15 3、凋亡细胞、凋亡小体被邻近特殊吞噬细胞或其它细胞识别与吞噬，需要一种特殊的非免疫性识别机制，最近发现吞噬细胞上至少有三类受体，凋亡细胞上出现有相应的凋亡标记，介导两者相互应答反应。

16 ①凋亡细胞表面膜结构改变，表面糖蛋白失去唾液酸侧键，使原来处于隐蔽状态的单糖暴露出来，与吞噬细胞表面的植物凝集素结合被吞噬。
②细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸翻露到细胞外，被吞噬细胞表面相应的受体识别、吞噬。 ③ 吞噬细胞可以分泌一种物质即血栓连接素（thrombospoudin），在血小板、巨噬细胞、内皮细胞、纤维母细胞中可粘附FN、纤维蛋白原和糖蛋白。 ④ 介导多种细胞表面的蛋白多糖、硫酸脂等受体与凋亡小体表面的相应成分结合而将之吞噬。

17 4、定时电动摄像研究发现，凋亡发生开始得很突然，受致死刺激后不久，被攻击的细胞突然皱缩,冒泡并凋亡，这时期仅仅持续数分钟，然后产生皱缩的凋亡小体。凋亡小体一旦形成，停留在组织中被辩认出来的时间约4-9小时，这段时间与巨噬细胞在体内吞噬大生物结构完全被降解的时间相符，由于这一过程很短，因此在组织切片中，所见到的凋亡小体即便是少量的增加，也可能隐藏着较大的细胞丧失率，例如在历经3天细胞数目已丧失一半的萎缩组织中，这时在光镜下见到的凋亡小体数还不到细胞总数的5%。

18 凋亡发生迅速，在几小时内即完成主要的二个阶段：细胞死亡阶段（the dying process）和细胞被清除过程（the elimination process）。凋亡细胞迅速被吞噬，其空隙由周围细胞来填充，因此不留痕迹，凋亡小体的完整膜，使之缺乏炎症反应。

19 5、尽管凋亡对细胞死亡来说是非常有意义的生物行为，但仍含糊不清的概念，其后果是凋亡表现在不同组织中，有不同的名称，如：
①着色体的巨噬细胞（tingible body macrophages）在淋巴滤泡生发中心中存在的含有凋亡淋巴细胞的巨噬细胞； ②civattebodies在牛皮癣时所见到的凋亡性角化细胞; ③councilman bodies凋亡的肝细胞等。

20 civattebodies在牛皮癣时所见到的凋亡性角化细胞

21 镜下 肝细胞嗜酸性小体 H.E × 50

22 镜下 凋亡小体 apoptotic body H.E × 40

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25 四、凋亡发生的机制 主要通过受体介导的信号途径（receptor-mediated cellular signalling pathways）诱导细胞凋亡因子或刺激因素通过第二信使系统传递信号，信号传递途径决定了细胞的命运。 核酸内切酶 bpDNA片段 各种内源性 细胞内钙离子浓度增加 蛋白酶 细胞骨架崩解 细胞皱缩 和外源性刺激 （细胞内降解级联） 转谷氨酰胺酶 胞浆蛋白交联 细胞固缩

26 1、核酸内切酶（endonuclease）的活化将DNA在核小体间连接区（internucleosomal linkage region）
切成缺口(Nick),使核内DNA断成片断，而胞浆DNA保留完好。DNA断点都是规律性的发生于核小体之间，因此出现 bp及其倍数的DNA片段。 2、组织转谷氨酰胺酶（tissue tranglutaninase TTG) 活化催化εlr-谷氨酰赖氨酸交联形成僵硬而不溶性蛋白，在老化与终末分化的角化上皮中TTG活化形成包鞘蛋白（involucrin)，这些蛋白可以网络住细胞内细胞器等容物，不易溢出。

27 3、钙依赖蛋白酶（calcium-dependent proteinase)活化破坏细胞骨架结构，形成细胞表面泡状起。
如果阻断胞浆钙浓度可以抑制凋亡发生，增加胞浆钙浓度可以促进凋亡。 所谓自发性（spontaneous）凋亡的发生，是组织内区域对各种致畸物（teratogen）异体生物素（Xenobiotics）十分敏感，这也是细胞衰老的特征，是对许多损伤性刺激的极度脆性。所以在生化水平上凋亡细胞可以发生一系列基因表达和蛋白合成。

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29 细胞凋亡的途径 来自细胞内外的各种信号可诱导不同的细胞发生凋亡，但凋亡的不同类型细胞却呈现一致的特征性形态和生化改变，这些改变由半胱氨酸蛋白酶家族(caspases)蛋白降解所造成。 按启动caspase酶和信号转导机制的不同，将凋亡的发生分为两条途径： 外源性：即死亡受体（death receptor，DR）介导途径； 内源性：也称为线粒体介导途径。 它们通过一系列分子和生物化学途径导致两个途径共同的“中央处理器”分子即caspase的活化，并诱导许多细胞核和细胞浆内相关底物的降解。

30 1、外源性途径及其主要成分的结构、功能与激活
⑴ 死亡配体（death ligands）结合DR而促发的凋亡，这些配体包括TNF， FasL，TRAIL， Apo3L，也称为死亡因子，相应的死亡受体包括TNF-R， Fas， CD40， OX40， 4-1BB，它们胞内区都具有一约80个氨基酸残基组成的保守的蛋白结合域，是传导细胞死亡信号所必须的，称之为死亡功能域(death domain， DD)

31 Fas/FasL系统 FasL与Fas结合可以导致Fas胞内的死亡域形成三聚体而活化， 并引起与之结合的FADD构象改变， 使caspase-8前体激活， 从而激发一系列下游的caspase级联反应， 诱发细胞凋亡。这是一条基本的通过DD和FADD的细胞凋亡调控途径。Fas L和Fas系统除了大家已熟知的诱导死亡的功能外，还有导致细胞活化和增生的功能 。

32 ⑶ 肿瘤坏死因子（TNF）系统 TNF是由157个氨基酸亚单位组成的同源三聚体，主要是由因为感染而活化的巨噬细胞和T细胞产生， 通过TNF-R1， TNF可以诱导细胞凋亡。 TNF三聚体与TNF-R1的胞外功能域结合，启动信号转导，募集TNF - R1 启动的信号转导中的关键酶与蛋白结构域的活化。

33 2、线粒体途径及其主要成分的结构、功能与激活
⑴ 线粒体结构及基本激活途径 启动凋亡的关键因素是线粒体功能紊乱。线粒体是双层膜包裹的囊状结构其上含有丰富的腺苷酸载体(adenine nucleotide transporter， ANT)、电压依赖性离子通道(voltage-dependent anion channel， VDAC)、bcl-2分子等。外膜通透性较大，容许分子量在15KD以下的物质自由通过，内膜通透性小，大于1.5KD物质不易通过。该双层膜通透性的改变在细胞凋亡中起重要作用，而外膜通透性改变与内膜相比更具有凋亡特征。

34 线粒体调节细胞凋亡有3 种机制: ① 线粒体电子传递与能量代谢的破坏; ② 细胞氧化状态的改变;
③ 线粒体膜通透性改变导致介导细胞凋亡的分子的释放。

35 线粒体膜通透性的改变可释放多种分子启动凋亡
caspase 前体 细胞色素c（Cyt-c，caspase的激活剂) 第二个线粒体来源促凋亡的caspases激活剂/低等电点的直接结合IAP蛋白(Smac/Diablo ，caspase 的协同激活剂) 凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF，激活核酸酶裂解DNA成小片段)、 凋亡蛋白抑制剂(inhibitor of apoptosis proteins，IAP，caspase的直接抑制剂)、 内核酸酶-G(endonuclease G) 等。

36 ⑵ 细胞色素c （Cyt-c） Cyt-c是线粒体呼吸链的重要组成之一。
细胞损伤后，线粒体膜通透性增高是释放Cyt-c ， 并与细胞凋亡激活因子1(apoptotic protease activating factor 1， Apaf-1， 线虫ced-4的同源物) 结合， 并活化caspase-9前体， 进而激活caspase-3，引发caspases级联反应， 从而诱发细胞凋亡。 在脊椎动物细胞凋亡过程中， 线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置。

37 ⑶ 凋亡体( apoptosome) 凋亡体也称为死亡复合体(death complexes)， 是细胞线粒体对凋亡性死亡作出反应的关键步骤，它是由线粒体通透性增高而释放的某些线粒体蛋白如Cyt-c、Smac/Diablo等启动的，由Cyt-c和Apaf-1形成七聚体的凋亡体(heptameric apoptosome)，再通过它的caspase募集功能域(caspase recruitment domain， CARD)募集并激活caspase-9前体，激活caspase-3，caspase-6，caspase-7，使凋亡达到了顶峰。

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39 五、凋亡与坏死主要鉴别（形态学） 凋 亡 坏 死 细胞形态 细胞膜出芽，冒泡但完整性 好，活组织中个别细胞死亡 细胞完整性破坏
凋 亡 坏 死 细胞形态 细胞膜出芽，冒泡但完整性 好，活组织中个别细胞死亡 细胞完整性破坏 成片细胞死亡，破坏组织结构 过 程 固缩核，浓染胞浆，脱离。凋亡小体 细胞肿胀，核淡染，凝固性坏死， 无膜性小体 细胞器 细胞器未遭破坏，胞浆浓缩 细胞器肿胀溶解 染色质 染色质致密，凝集或边集浓染 染色质疏松变性粗糙 染料排斥试验 开始被排斥 染料掺入（膜破坏或通透性↑） DNA破坏机制 核酸内切酶作用核酸DNA裂解为200bp或其倍数片断（核孔裂开） 随机降解弥漫ATP膜损伤， 氧自由基损伤 结局 凋亡小体可被同种或异种细胞识别吞噬 吞噬细胞吞噬细胞碎片，溶解 组织反应 不引起炎症反应，迅速退 化，无整个组织瓦解，不诱发组织的再生与修复，细胞生长增殖→凋亡 引起炎症反应，继发性组织损伤， 诱发组织再生与修复，形成疤痕， 坏死→补偿性增生→细胞增殖

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41 六、凋亡与增生、萎缩 在静止细胞和终末期细胞中诱导细胞凋亡是困难的，因为细胞内不出现凋亡分子，细胞凋亡分子不会在所有的细胞类型和内环境稳定的条件下出现。

42 2、细胞因子（Cytokines）的作用:
细胞因子是由多种细胞合成和释放的，是有生物活性的蛋白和多肽之统称。主要有5类： （1）、生长因子（growth factors）； （2）、克隆刺激因子（colony stimulating factors） （3）、白介素 （interleukin）； （4）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis fctors TNF） （5）、干扰素 （interferon）。

43 细胞因子通过信号传导与细胞因子受体结合而产生效应。一旦细胞因子释放减少、或信号传导、或受体障碍就会引起效应细胞的凋亡发生。如前列腺，肾上腺皮质在嗜该器官激素减少后（由于手术或药物的方法）以及哺乳后的乳腺的生理萎缩与退化中，结扎主导管后腮腺的萎缩，部分由上皮细胞凋亡而介导。当然萎缩还累及到细胞间质的丧失和残留活细胞体积的缩小，这些改变虽然与凋亡相互协调，却与凋亡截然不同。

44 在部分生理性萎缩与退化中有凋亡机制参与，凋亡在正常周期性刺激的上皮，包括人体子宫内膜表皮等细胞更新中与核分裂相平衡。在某些情况下凋亡明显表现为某些细胞（选择性）如睾丸经放射或暴露于放射性药物后，精原细胞选择性死亡，而间质细胞却保留着（使性功能，性特征保留，但生育能力降低）。

45 七、凋亡与炎症 炎症的基本病变中，渗出是最重要的，没有渗出就不称为炎症。炎症时从血管渗出的中性白细胞，在病灶中完成抗炎功能后，不能重回血管，需要启动细胞凋亡的机制，使炎症终止。 创口修复中的肉芽组织，成纤维细胞增生与胶原分泌，以及随后纤维母细胞转变为纤维细胞，及疤痕形成，凋亡机制也可能参与愈合。

46 研究自身免疫性疾病、病毒感染中自身反应性T、B淋巴细胞、对某些病毒感染细胞、细胞毒性靶细胞和一些肿瘤细胞，通过凋亡的方式，来清除与消退。
淋巴细胞发育成熟过程中，约有95%的细胞发生凋亡，TC抗原受体（TCR）基因发生重排时，TCR基因某一连接点上发生等位基因无意义突变，细胞即走向凋亡。即使产生正确TCR分子的细胞还必须经过进一步的严格选择机制，使可能导致自身免疫性疾病的细胞凋亡，这就是胸腺的阴性选择机制。

47 B淋巴细胞的发育过程与TC相似，编码免疫球蛋白的基因片断要经过基因重排，才能在细胞表面产生独特的个体型免疫球蛋白的受体。如果发生错误重组，表面免疫球蛋白（SIG）就不能正常表达，引起克隆消除，从而把可能引起自身反应性的BC清除掉，这就是BC的阴性选择机制。 成熟的WBC的寿命以天计算，死一批，生一批，互相交替，严格有序，若细胞凋亡障碍，只生不死，就会发生WBC堆积，WBC增生症。 对自身抗原反应的细胞该死的不死，还会发生自身免疫性疾病。

48 八、凋亡与肿瘤 肿瘤形成除癌基因激活外，还伴有一个或多个抑癌基因功能的丧失，而且凋亡理论的研究无疑对肿瘤研究产生了重大的影响，并使人们对肿瘤发生机制的认识有了一个观念上的更新。原来肿瘤形成不仅是瘤细胞的过度增生，还存在死亡过少，凋亡机制障碍，细胞凋亡参与癌症起始过程，并对癌症发生负调控作用。

49 （一）凋亡对肿瘤的影响 1、细胞增生↑↑ 凋亡↓ 2、细胞增生↑凋亡变化不显著 3、细胞增生↑↑ 凋亡↑ 增生>凋亡,

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51 增加凋亡能干预肿瘤的发生与发展，许多肿瘤凋亡指数（Apoptotic index AI）与肿瘤进展、预后有关。如：
①基底细胞癌（basel cell carcinoma）就癌细胞来说其异型性和分化程度应为高度恶性的肿瘤，但其生物学行为为低度恶性表现，仅为局部浸润很少转移。研究发现该肿瘤中细胞凋亡明显，这对降低肿瘤浸润与转移有一定关系。 ②乳腺癌：作为激素控制的靶器官，乳腺细胞凋亡受激素控制，细胞凋亡调控异常是乳癌发生的原因之一。ER/PR（+）的乳腺癌抗雌激素治疗,或卵巢切除去势疗法能使瘤细胞发生凋亡。BCl-2阳性乳癌，产生耐药主要是抑制化疗药物阿霉素诱发细胞凋亡的作用。

52 ③ 前列腺癌是男性常见肿瘤，随着前列腺特异性
抗原（prostatic specific antigen）的应用，新发现的前列腺癌急剧增多。雄激素依赖型前列腺癌(Androgen drpendent prostatic carcinoma ADPC )BCl-2 （－）时，性腺切除、雄激素拮抗剂的治疗有效，其机制是对雄激素敏感的癌细胞在缺乏雄激素后凋亡。雄激素非依赖型前列腺癌（Androgen Independent prostatic carcinoma AIPC） BCl-2（+）时，治疗效果差。转移性前列腺癌70%病人只有短暂疗效，3年内复发转变为AIPC，新研究发现抗寄生虫药“苏拉明（suramin）可诱导AIPC中癌细胞凋亡。

53 ④ 膀胱癌也是一种常见肿瘤，复发率高，10-25%浸润，预后差。研究结果显示，从正常移行上皮演变为Ⅰ级、Ⅱ级的膀胱癌时BCl-2表达明显低于Ⅲ级膀胱癌，提示BCl-2可能在肿瘤进展和转移中起一定作用。
⑤ 小细胞肺癌BCl-2、 BCl-XL表达为主；而非小细胞肺癌以BCl-XL为主，BCl-I基因家族表达的失衡对肺癌细胞凋亡有重要作用。总之增加癌细胞的凋亡能干扰肿瘤的生物学过程。

54 （二）肿瘤细胞凋亡与基因调控 ①细胞增殖抑制基因 根据调控基因功能分为两大类，这两类基因相互作决定细胞的生死命运。
[p35、p53、 RB、DOC（与粘附分子类似基因）、WT 、促进细胞凋亡的基因 （wimls tumor type-1）、DAD 1、等] [自杀基因（suicidal gene） 凋亡蛋白，凋亡基因] ②细胞凋亡促进基因（APO-1/Fas、TGF-β、SP2、Bax 、c-rel、Bel-XS、Bak） 2 抑制细胞凋亡的基因 ①促进细胞增殖的基因（c-myc 、c-eld 1、ras、 v-src） （生长基因/抗凋亡基因） ②抑制细胞凋亡的基因（Bcl-2、EIB 、LMW-5-HL、C-Kit 、Bel-XL）

55 （三）凋亡相关基因有三类： 1、细胞凋亡过程表达的基因 ，多数抑癌基因； 2、促细胞凋亡基因，多数抑癌基因；
3、抑制细胞凋亡基因，多数癌基因。

56 凋亡与细胞增殖有许多潜在的联系。从细胞形态学上看，细胞凋亡与有丝分裂的超微结构事件，如核膜消失、染色体凝集、细胞膜内陷等有许多共同之处；从分子水平上看，有许多原癌基因和抑癌基因与细胞增殖和凋亡有关，它们通过各自的通道参与细胞凋亡的调控，研究较多的基因有BCL2、Caspase 家族、IAP家族、 Fas 、P53、C—myc等。

57 1.Bcl-2 家族 Bcl-2家族包含一组相关蛋白，它们分别与Bcl-2在4个保守区具有同源结构域(BH1-4)，并以此作为结构基础，形成同源性或异源性二聚体，通过蛋白—蛋白之间的相互作用，调节细胞的凋亡，在细胞凋亡途径的上游远端，构成一个重要的细胞内凋亡调控点。

58 （1） Bcl-2家族的组成

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60 细胞内Bax高表达时，细胞对死亡信号敏感，加速细胞凋亡，当Bcl-2高表达，Bcl-2可与Bax形成异源性二聚体，抑制细胞凋亡。所以Bcl-2／Bax的比例对决定细胞凋亡的敏感性起重要作用，抑制凋亡因子/促进凋亡因子的总比率，最终决定细胞的的生存或死亡。

61 （4） Bcl-2在肿瘤中的表达与肿瘤的发生：
Bcl-2在多种肿瘤中的表达已得到证实。一般来说，Bcl-2阳性的肿瘤要比Bcl-2阴性的肿瘤预后差。在一些比较常见的恶性肿瘤中，Bcl-2表达经常阳性的有：慢性淋巴细胞白血病、慢性髓白血病伴有原始细胞危象者和急性髓白血病几乎l00％阳性，滤泡淋巴瘤80％阳性，T、B非霍奇金淋巴瘤65％阳性，霍奇金淋巴瘤40％阳性，乳腺癌80％阳性，神经母细胞瘤40％阳性，鼻咽癌80％阳性，前列腺癌75％阳性，肺鳞癌25％阳性，肺腺癌10％--15％阳性。

62 在85％的滤泡型恶性淋巴瘤，存在t(14；18)(q32；q21)。这一染色体易位使位于14号染色体长臂的免疫球蛋白重链基因和位于18号染色体的bcl—2基因的转录活性位点拼接，造成bcl—2基因的过度表达，使B淋巴细胞免予凋亡而长期存活，并可能附加其他基因的突变而发展成淋巴瘤。Bcl-2的免疫染色最常用于区别反应性滤泡性淋巴瘤。 在甲状腺中，Bcl-2抗体还不能用于区别桥本甲状腺炎和低分化MALT淋巴瘤。

63 Bcl-2

64 Follicular lymphoma (Bcl-2 immunostaining)

65 Follicular lymphoma: Bcl-2

66 反应性增生淋巴结

67 Bcl-2 免疫染色

68 在生发中心Bcl-2 阳性: 如何判断?

69 同时做CD3 免疫染色证实为生发中心T细胞浸润

70 2. Caspase 家族 Caspase家族是一组蛋白酶，介导即将死亡的细胞高效而特异的蛋白水解作用，是细胞凋亡的执行者。
①、都是半胱氨酸蛋白酶； ②、作用部位都在天冬氨酸残基后的位点.

71 caspase-4(TX/ICH-2/ICEref-Ⅱ) 炎症 caspase-5(TY/ICEref-Ⅲ) 炎症
凋亡 其它 caspase-4(TX/ICH-2/ICEref-Ⅱ) 炎症 caspase-5(TY/ICEref-Ⅲ) 炎症 caspase-13(ERICE) mcaspase-11(ICH-3) mcaspase 炎症 caspase-1(ICE) 炎症 caspase-14(MICE) caspase-3(CPP32/apopain/Yama) 效应者酶 caspase-7(Mch3/ICE-LAP3/CMH-1) 效应者酶 caspase-6(Mch2) 效应者酶 caspase-8(MACH/FLICE/Mch5) 启动者酶 caspase-10(Mch4) 启动者酶 caspase-2(ICH-1/mNedd2) 启动者酶 caspase-9(ICE-LAP6/Mch6) 启动者酶 CED3

72 ⑴Caspase家族的组成 至今已发现有14种Caspase，分为3组。

73 (2)Caspase的活化途径 Caspase家族的蛋白都是以非活性的酶原方式存在于胞质中，当它们通过一定的途径被活化后，依据一定的顺序，裂解一些重要的蛋白底物，导致相应底物的活化或灭活，最后可能需通过信号转导途径，产生凋亡细胞的一系列的形态和生物化学的改变。

74 3. IAP家族 IAP家族是抑制细胞凋亡作用的一组蛋白。在人类已确认有6种IAP相关蛋白(NAIP、c-IAP1／hIAP-2、c-IAP2／hIAP-1、 XIAP/hICP、Survivin和BRUCE)，有研究表明，以上蛋白的过表达，都可以不同程度地抑制多种因素如TNFR、Fas受体介导的、柔红霉素、VP－16诱导的以及去除生长因子后所引起细胞凋亡。有研究表明在酵母和哺乳动物细胞中，IAP家族蛋白抑制caspase的活性，抑制细胞凋亡，作用强度为XIAP>c-IAP2＞c-IAPl＞Survivin。

75 5种IAP在人体内的不同组织中分布不同。 XIAP分布较广，除外周血的白细胞以外，成人或胚胎的其他组织中均有表达； c－lAPl、c－IAP2在肾、小肠、肝、肺和神经系统（低级）表达较高。 NAIP在成人肝、胎盘中有所表达，脑中亦有微量表达，RT－PCR方法可检测到。 Survivin 在正常细胞中，除了正在分裂的细胞之外，它在成熟的终末分化组织中基本无表达，而在胚胎发育过程中和人的部分肿瘤组织中表达，是一个新的肿瘤标记，有报道说，Survivin与肿瘤细胞的抗药性、肿瘤转移过程中的血管生成以及某些肿瘤如神经母细胞瘤等的预后不良有关。

76 4、Fas： 也称为APO-1（CD95），是1989年两家实验室同时发现在细胞株表面介导凋亡的蛋白分子，属于NTFR（肿瘤坏死因子受体）和NGFR（N生长因子受体）家族，分子量45000，细胞膜抗原，能抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，许多耐药与复发的肿瘤中CD95和Fasl突变，尤其在淋巴瘤、白血病和肠癌病人中常有Fas APO-1的表达，对预后有一定影响。Fasl为T淋巴细胞上Fas的天然配基（ligant），Fasl与表达Fas的细胞结合、即导致后者走向凋亡。

77 5、P53： 对P53的认识分三个阶段，在80年代初一经发现就认为是一种肿瘤基因，后来发现主要表现在癌中所以称为癌基因，经过相当一段时间后，随着对凋亡研究的深入，89年才证明P53为抑癌基因（肿瘤基因→癌基因→抑癌基因）。正常细胞内存在野生型P53对细胞增殖有抑制作用。 研究发现细胞在转化过程中表达P53有三种情况： ①无变化；②细胞停滞在G1期；③细胞凋亡。

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81 6、c-myc： 转录调节因子c-myc在多种肿瘤中高表达，对增殖和凋亡均有调控作用，它能够促进细胞增殖、诱导细胞凋亡和抑制细胞分化，即使在有的肿瘤细胞(如HL-60白血病细胞)不能直接促进凋亡，它也能增加细胞对各种凋亡诱导因素的敏感性。当某些抑癌因素存在时（抗癌因子，低浓度血清，抑止细胞周期因子）、c-myc蛋白促进细胞凋亡。当有致癌因素存在时c-myc蛋白促进癌细胞增殖。

82 7、其他与细胞凋亡有关的基因： ①死亡基因ced3 、ced4. ICE(interleukin-l p-converting enzyme)是哺乳动物细胞的凋亡蛋白酶，与线虫凋亡基因ced3同源，在细胞凋亡中起“刽子手”作用，可以诱导多种类型的凋亡；但是ICE介导的细胞凋亡受BCL2所抑制。 ②吞噬基因参与凋亡细胞吞噬，并非导致细胞死亡，如ced1、ced2、ced6、ced7、ced8； ③核酶基因 Nmc-1

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84 (四)凋亡与肿瘤治疗的研究 鉴于凋亡是肿瘤细胞死亡的一种形式，又有如此众多的癌基因和抑癌基因参与凋亡的调控，因而人为地施加影响以激发凋亡诱导基因的活性和降低凋亡抑制基因的活性，可能是治疗肿瘤的有效途径。事实上，目前临床上所采用的各种抗肿瘤的治疗方法如化疗、放疗、物理治疗、生物治疗、促细胞分化治疗甚或基因治疗多是通过诱导细胞凋亡，以求达到治疗肿瘤的目的。

85 肿瘤的疗效判定应考虑到： ①、是否经过治疗后发生凋亡，这是肿瘤化疗效果好坏的关键之一；
②、增加凋亡指数（Apoptosis Index）与增生指数(proliferatory Index)的比值AI/PI，已成为新的治疗目标； ③、同时能否诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新标 准； ④、诱导细胞凋亡的治疗将是对肿瘤治疗方法的重要补充与革新。

86 目前治疗肿瘤的新设想——在肿瘤治疗中诱导凋亡。
1、导入P53（野生型WT）抑制肿瘤增生； 2、下调突变型P53, BCl-2的活性与表达，减弱其对细 胞凋亡的抑制； 3、抑癌基因引入瘤细胞，降低致瘤性，使肿瘤细胞逆转为正常细胞； 4、引入某些细胞因子，抑制肿瘤恶性表型，使细胞丧失致瘤性； 5、应用点突变技术，使异常表达癌基因失活或修复突变基因； 6、导入药物敏感基因，有助于细胞凋亡；

87 九、凋亡与其他疾病 1、细胞凋亡异常增加（不该死的死了） ①神经系统退行性变：a、老年性痴呆；b 色素性视网膜炎；c、帕金氏综合征
②骨髓发育不良综合征（恶性贫血） ③缺血性损伤：心肌梗死；缺血缺氧性脑病；肾小球肾炎 ④肝病变：病毒性肝炎和酒精性肝炎 ⑤AIDS

88 2、细胞凋亡过度减少（该死的不死）： ①自身免疫性疾病：a、系统性红斑狼疮（SLE） ； b、肾小球肾炎（GN）等
②肿瘤：a、激素依赖性肿瘤（乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌）；b、造血系统肿瘤（淋巴瘤、白血病）等 ③各种病毒感染：腺病毒、疱疹病毒、痘病毒等

89 十、凋亡的检测方法 1972年keer提出细胞凋亡的概念， 1980年用电泳检测细胞凋亡，并证实了DNA断裂的特征。 1986年在秀丽降杆线虫（caeovhabditis elegan）中观察1090个体细胞，其中131个细胞在发育过程中通过凋亡而消失，并找到两个基因ced3 、ced4，他们的表达与细胞凋亡密切相关，故称为死亡基因。因此细胞凋亡的检测经历以下几个过程； 从单纯形态学辩认→形态与生化结合→形态、生化、分子生物学技术相结合的多种手段。

90 （一）凋亡检测要解决的问题是： 1、被研究体系中是否有凋亡发生，即定性。
2、凋亡的发生率，显示群体细胞的量度。这是一个相对的概念，应同时结合细胞群体的增殖率来分析，则更客观，更能反应细胞群体的生长状态。 3、了解细胞凋亡的严重度，以反应凋亡的阶段。

91 （二）检测细胞凋亡各种形态学方法比较 检查方法 可鉴定凋亡细胞的特征 光学显微镜（LM） 细胞缩小、核浓缩、细胞周围透明圈
检查方法 可鉴定凋亡细胞的特征 光学显微镜（LM） 细胞缩小、核浓缩、细胞周围透明圈 相差显微镜（PCLM） 细胞鼓泡，凋亡小体 透射电镜（TEM） 微绒毛消失、核染色质沿核膜分布 新月体形成、凋亡小体 激光共聚焦（CLSM） 凋亡细胞固缩染色质及核碎片定位 扫描电镜（SEM） 细胞表面泡状突起 流式细胞仪（FCM） 低前向散射光、高侧向散射光 缩时摄影术（TLP） 凋亡细胞的形成过程

92 2、流式细胞仪检测 细胞凋亡时膜通透性增加介于正常细胞与坏死细胞之间，用荧光素染色细胞悬液，利用流式细胞仪测量细胞悬液中的细胞荧光强度来区分正常细胞、凋亡细胞、坏死细胞。常用Hoechs-PI染色，正常细胞对染料拒染，荧光着色淡。凋亡细胞主要摄取Hoechs染料呈强蓝色荧光。坏死细胞DNA有强的嗜PI性呈强的红色荧光。

93 3、核酸电泳检测细胞凋亡 （DNA片断检测细胞凋亡）
细胞凋亡和坏死时，细胞中DNA发生断裂，小分子DNA片断增加，高分子DNA减少，胞浆内出现DNA片断，然而凋亡细胞的DNA断裂是由内源性的内切酶作用，断点都是规律性的发生在核小体之间，因此出现 bp及其倍数的DNA片断。坏死细胞的DNA片断是无特征的杂乱片断。在凝胶电泳中出现的特征性的泳带可以判断凋亡细胞，这方法缺乏定位特性，无法确定哪个细胞发生凋亡。

94 4、酶联免疫吸附法(ELISA 法) ELISA 方法检测细胞凋亡后形成的由组蛋白及DNA片断组成的核小体。此方法敏感性高， 所需细胞数少， 可检测低至5×102/m L 的凋亡细胞。此外， 此方法不需特殊仪器， 比较适合基层工作。 缺点: (1)不能精确测定凋亡发生的绝对量; (2) 适合单一成分细胞的检测， 对于多细胞成分的组织或细胞混合物， 不能判定凋亡发生在哪种细胞; (3) 不能提供单个细胞或相关细胞的组织学定位。

95 5、DNA片断原位标记 1993年Wifsman等提出DNA片断末端标记法， Fehsel等1994年提出原位缺口转移检测细胞凋亡的方法。这些方法的提出把凋亡研究带进了新阶段，特别是这些技术发展为原位凋亡检测试剂盒，早期凋亡的检出TUNEL。 缺点: (1)坏死细胞亦有DNA 裂点形成，也可呈现TUNEL反应阳性， 因而特异性较差。 (2)TUNEL结合免疫组化检测时， 固定过程对检测的影响较大， 切片的大小、薄厚会直接影响到固定效果， 从而产生结果的差异。

96 Tunel反应：探针＋靶核酸 DNA-DNA 为间接法
杂交体 标记探针 半抗原标记物 探针 杂交体 靶核酸 显色 酶标特异性抗体 间接法原位杂交示意图

97

98 DAB 镜下控制 显色 水洗 ％酒精 ％酒精 ％酒精 无水酒精 （Tunel检测法）

99 灌注固定大鼠肝，Tunel反应阳性，DAB显色，血管内无红细胞背景染色。×125

100 非灌注固定大鼠肝，Tunel反应阳性，肝细胞核BCIP/NBT显色呈紫黑色，血管内红细胞呈桃红色。 ×250

101 RNA酶(RNase)保护实验 这种高度敏感的实验技术来源于对某些噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶的研究， 这种酶是从DNA模板上合成高度特异性RNA探针的理想工具， 用来检测和定量研究mRNA。这样， cDNA片断可以被克隆到含有噬菌体引物的质粒中， 并可用来合成放射性标记的反义RNA探针。 应用人类凋亡模板试剂盒中32P标记的反义RNA探针与从标本中分离的RNA 杂交， 再行RNA酶处理。最后用放射自显影或吸光度分析法分析翻译产物。此实验的优点是敏感性高， 可在一份总的RNA 标本中同时定性不同种类的mRNA

102 用RT-PCR 方法进行mRNA 的半定量分析
提取细胞的RNA ， 与逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNA sin) 和dNTP孵育合成cDNA， 然后在特异性cDNA引物诱导下进行PCR反应， 最后琼脂糖凝胶电泳测定PCR 反应产物的大小。实验的灵敏性很高， 但是对于细胞组成不单纯的组织或细胞悬液说来， 不能确定与凋亡相关基因的mRNA来源于哪类细胞， 所以还应当进行蛋白表达的研究。

103 截止目前为止，凋亡检测的方法已有许多种，但任何一种方法都有自身的缺点和应用的局限性，影响检测结果的判断和意义分析。如果需要解决这些问题，在检测中已测出有凋亡发生时，如何解释结果？如何与疾病和肿瘤的发生发展联系起来呢？

104 ①首先我们必须建立正常时该体系的凋亡状态，正常对照组，以判断检测组凋亡是生理性，还是病理性。
②同时检测该体系细胞增殖状态，对照该体系的增殖指数和凋亡指数，以判断该体系细胞周转率。 ③建立致病因素对被测体系影响的对照组，确定该致病因素与被测体系细胞增殖、凋亡的相关性（对照组的控制）。 ④如何定量与排除其它干扰。

105 十一、凋亡的生物学意义 细胞凋亡是生物体内无用的、老化的、或一些损伤的细胞死亡的一种形式，不引起局部组织损伤或炎症反应，主要意义在于生物进化的需要。竞争性的选择机制，是保证个体发育、成熟、和维持正常生理过程所必需。 1、清除多余的细胞 2、清除无用的细胞 3、清除有害的细胞 4、清除衰老的细胞 5、有选择性地清除细胞

106 十二、存在的问题与展望 虽然发现细胞凋亡的现象已经近40年，但人们真正认识到其重大的理论和实际意义，还是近几年的事。细胞凋亡分子机制的研究说明细胞的凋亡过程是受基因调控，是主动连续的程序化反应，在细胞凋亡研究中还有许多关键问题末解决。

107 1、在细胞发育过程中 ①细胞凋亡究竟是何时，又是如何开始的？（时间与方式）； ② 机体是如何决定一个细胞将要走向死亡的 ；
② 机体是如何决定一个细胞将要走向死亡的 ； ③ 在细胞有丝分裂和成熟之间有没有能激活细胞凋亡的开关点基因（Switch point gene）存在？

108 2、机体内有没有真正的杀手基因（Killer gene）存在? 死亡相关基因是如何调控的？
3、细胞凋亡究竟是通过哪些信号传导途径起作用？ 4、哪些疾病与细胞凋亡规律失常有关？ 能否通过调控细胞凋亡来达到治疗目的？ 5、细胞凋亡与衰老的关系如何？ 是否有活命基因（survival gene）的存在?

109 如果能发现凋亡特异性的基因或其产物，或其他特异性的标志物，就可能成为检测凋亡的指标。目前对凋亡的认识是一个连续的过程，进一步研究也许会发现凋亡存在不同的阶段，而不同阶段可能会出现不同的标志物，从而发现凋亡阶段性标记物。 凋亡机制在细胞生长、发育过程中所具有的独特的生物学效应，可以通过增加或降低某些特定的细胞对凋亡的敏感性来发展治疗疾病的新方法和药物。 阻断凋亡可能有利于艾滋病的治疗，某些N激素的基因替代疗法可能对中枢N系统的退行性病变有益。

110 应该承认对细胞凋亡的研究还刚刚开始，如何利用分子生物学和细胞生物学等当代最新技术，从分子水平上深入揭示细胞凋亡的启动，发生和发展规律，为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡稳定、自身免疫性疾病、肿瘤形成的原因等增加新的理论内容，并以此来指导医疗实践，还有很多工作要做。

111 谢谢！