免疫学实验 D 一． ELISpot 二．免疫学讨论 三．制备细菌培养基. 一． ELISpot.

Presentation on theme: "免疫学实验 D 一． ELISpot 二．免疫学讨论 三．制备细菌培养基. 一． ELISpot."— Presentation transcript:

1 免疫学实验 D 一． ELISpot 二．免疫学讨论 三．制备细菌培养基

2 一． ELISpot

3 ELISpot 优点 1 可以检测特定细胞亚群中特定细胞因子的 表达水平，少至 100 － 1000 个分子 /Cell 即 能够被检测。比 ELISA 灵敏度高 200 倍 2 在单细胞水平，单个阳性效应细胞即能够 被检出。比 FACS 灵敏 100 － 1000 倍

4 提前一周用 OVA 免疫小鼠 第一天 1. 75% 乙醇加 100  L/ 孔 ( 清洗 ) ，预温 30 〞 2. PBS 洗板 3 次 3. 稀释 Ab 包被 (anti-IFN  100  L+100  L PBS) ， 4 ℃过夜 第二天 4. PBS 洗板 1 次 5. 每孔加 100  L 2% 乳液封闭，封盖，室温 2h 6. 弃液，翻板于吸水纸上轻叩 7. PBS 洗板 1 次 8. 每孔加 100  L 细胞悬液和刺激剂 OVA ，封盖， 37 ℃ CO 2 孵箱 培养 10-15h 细胞悬液 每列最末孔为空白对照，加 100  L1640 ，封盖 实验方法 ( 以小组为单位 )

5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B OVA C D E F G H 1640

6 第三天 9. 弃液，翻板于吸水纸上轻叩 10. PBS 洗板 4 次 11. 加入检测 Ab100  L/ 孔，封盖， 37 ℃孵育 1h 12. 弃液， PBS 洗板 3 次 13. 每孔加亲和素 -HRP 稀释液 100  L ，封盖， 37 ℃孵育 1h 14. 弃液， PBS- 吐温 20 ，洗板 3 次，轻叩去除残留缓冲液 15. 加底物 100  L/ 孔 16. 置室温 2-10 min, 肉眼观察斑点 17. 自来水洗 3 次 18. 干板，读板（ 4 ℃过夜后斑点更清晰） 19. 室温避光保存

7 结果观察 目测机读

8 二、免疫学讨论 带领学生复习免疫学学过的知识

9 厌氧培养基 基础培养基 营养培养基 选择培养基 鉴别培养基 特殊培养基 按营养组成 和用途分类 按培养方式 分类 液体 沉淀生长 浑浊生长 表面生长 用于增菌 有鞭毛细菌 混浊生长 无鞭毛细菌 沿穿刺线生长 半固体 含 0.5% 琼 脂，用于 检测细菌 运动力和 保存菌种 固体 含 2-3% 琼脂， 用于分离鉴 定细菌 用于细菌 增殖、保 存菌种或 观察某些 生化特性 三、制备细菌培养基

10 1. 以新鲜牛肉浸膏 2% ，加入 2% 蛋白胨、 0.5%NaCI 及 0.1%Na 2 HPO 4 ，溶解后调节 PH 至 7.4-7.6 ； 2. 过滤后高压蒸汽灭菌 20min ； 3. 取出冷却，置 37ºC 孵箱 24h ，若无细菌生长即可备用 1. 在液体培养基中加入 0.5% 琼脂，加热溶化； 2. 分装入试管内，高压灭菌； 3. 取出直立，冷却至 45 ºC 以下； 4. 置 37ºC 孵箱 24h ，若无细菌生长即可备用 液体汤培养基 半固体培养基

11 1. 在液体培养基中加入 2-3% 琼脂，加热溶化，灭菌； 2. 取出冷却至 50-60 ºC ，以无菌操作倾入无菌平皿内； 3. 冷却至 45 ºC 以下； 4. 皿底朝上置 37ºC 孵箱 24h ，若无细菌生长即可备用 普通平板培养基 斜面培养基 1. 在液体培养基中加入 2-3% 琼脂，加热溶化，灭菌； 2. 取出冷却至 50-60 ºC ，以无菌操作分装入灭菌试管内； 3. 趁热将试管斜置，冷却至 45 ºC 以下 固体培养基

12 液体培养基 (4mL) 半固体培养基 (4mL) 斜面培养基 (4mL) 平板培养基 (15mL ，厚度 3cm 左右 ) 。 每半张桌子为一大组，每大组 12 人，每人需要液体 4+4+4+15=27mL ， 12 人共需 324mL ，预配出 400mL 。 配制要求 ( 每人都做 )

13 1. 在 400mL 水中加入 8g 的牛肉浸膏、 8g 的蛋白胨、 2g 的 NaCI 及 0.4g 的 Na2HPO4, 加热并搅拌 ( 用吸管或玻璃棒 ) 溶解 ( 牛肉浸膏的称量纸 需投入培养基中清洗 ) 后将 PH 值调到 7.4-7.6(PH 试纸 ); 分出加入 8g 的牛肉浸膏 加热 12×4mL=48mL ，还剩约 350mL ； 12 支管都盖紧塞子，用牛皮纸包 住上端后线绳扎成一捆，标记； 2. 剩余液体中加入 350×0.5%=1.75g 琼脂， 95 ℃加热搅拌溶解，分出 12×4mL=48mL ，还剩约 300mL ； 12 支管都盖紧塞子，用牛皮纸 包住上端后线绳扎成一捆，标记； 3. 剩余液体中加入 300×2%=6g 琼脂， 95 ℃加热搅拌溶解，分出 12×4mL=48mL ，还剩约 250mL ； 12 支管都盖紧塞子，用牛皮纸 包住上端后线绳扎成一捆，标记； 4. 剩余液体倒入三角烧瓶中，盖紧塞子，用牛皮纸和线绳封口，标记； 4. 所有试管及烧瓶放入塑料筐中，高压灭菌，待用。加水煮沸清洗吸 管和搪瓷筒。 配制方案

14 制备淋巴细胞悬液 1. 将 7d 前 OVA 免疫过的小鼠拉颈处死，取脾 2. 置脾于无菌培养皿，加 1640 液 2mL ，碾碎，取细胞悬液 于试管中 3. 1200rpm × 5min 4. 倾上清，沉淀物加氯化铵液 2-3mL ，混匀致红细胞溶解 5. 加 1640 液 2-3mL ， 1200rpm × 5min 6. 倾上清，沉淀物加 1640 液 2-3mL ，混匀 7. 取该悬液 10  L ，调节细胞数为 1 × 10 7 个 /mL

15 称量天平的使用方法 1. 打开电源，按 “on” ，再将刻度调到 0.0g( 质量称量位置 ) ； 2. 放称量纸，将示数重新调零； 3. 加上药品，读数。 电源 调质量称量钮 调零钮 称量区 示数区

16 培养基的溶解方法 溶解液体培 养基用 溶解含琼脂 的培养基用 开关