DNA重排的检测方法 马欣荣 高方远 康海歧.

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1 DNA重排的检测方法 马欣荣 高方远 康海歧

2 一、形态学观察 二、细胞遗传学 如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学 如：荧光原位杂交 四、分子生物学 如： Southern杂交，PCR及相关技术等

3 一、形态学观察 例子： 上个世纪40年代科学家B．McClintock
观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的，从而导致转座子的发现。 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。

4 二、细胞遗传学 染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的
染色体核型分析：观察中期染色体，初步分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加 常规核型分析 荧光核型分析 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY)

5 光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
　　 1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。 优势： 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到 1.5mb 碱基的转位 一次杂交即可分辨人的24条染色体

6 人染色体光谱核型分析

7 乳腺癌细胞染色体复杂的畸变

8 2.染色体显带技术： C-banding 主要染异染色质 R-banding 与C-banding 相反，主要染常 染色质区域 G-banding 是Giemsa 染色结果，产生深 浅不同的条带 Q-banding 是用喹丫因（quinacrine）染 色得到的荧光条带，带型与G带相似

9 G-带 c. 正常染色体 末端缺失 d. 末端倒位 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位

10 G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9、10、11染色体间易位，右为异常染色体

11 三、分子细胞遗传学 原位杂交（In situ hybridisation）
标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性，在不改变被分析对象，即维持其原位的前提下对靶核酸进行分析。 2. 荧光原位杂交 Fluorescent in situ hybridisation (FISH) 核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通过显微镜观察。

12 3. 染色体涂染(Chromosome painting)
又称为多重荧光原位杂交(multiplex- fluorescence in situ hybridisation, M-FISH) 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 测人的24条染色体 可检测简单及复杂的染色体重排

13 荧光原位杂交，据标记物不同可分为： 间接法：用生物素或地高辛标记探针， 通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。 直接法：直接用荧光素标记，如Vysis 公司的FISH探针。

14 荧光原位杂交原理示意

15 荧光原位杂交过程

16 急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位 10、11号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点

17 小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位

18 染色体涂染显示人染色体组

19 荧光标记探针 不对环境构成污染 灵敏度能得到保障 可进行多色观察分析，可同时使用多个 探针，缩短因单个探针分开使用导致的
周期过长和技术障碍。

20 4. 比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization (CGH) 原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂
交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析 是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具

21 比较基因组杂交原理示意 肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少
等比混合 肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少 因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失 比较基因组杂交原理示意

22 比较基因组杂交过程

23 DAPI 4’,6-二联脒-2- 吲哚苯 TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明 FITC 异硫氰酸酯 人染色体不同荧光素染色结果

24 数字化图像

25 FITC/TRITC 荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITC

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27 应用： 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 物种间染色体同源性比较 优势： 可快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道DNA发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减

28 四、分子生物学技术 1. Southern-blotting 首先进行的。 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限制
  应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等 首先进行的。 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限制 性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 在 (>1~5%），克隆性的基因重排条带就 可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥 散带。

29 Figure 5. _Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene
Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with EcoRI, BamHI, and HindIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control

30   优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、
Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的“金标准”。 局限：需要较大量（10mg）新鲜或冰冻组织， 操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长（约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不 适用于临床诊断。 改进：荧光素标记IgH、 Igk、Igl及各种TCR探 针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5~10 分钟)，并且敏感性不降低，非常有利于在临床 诊断中推广、应用。

31 2. 常规PCR技术 DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异，由此可以检测DNA重排
淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果，其特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（T细胞受体）的V、D、J、C区基因编码中20 个左右的保守核苷酸序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物，以待测样品DNA为模板，扩增目的DNA序列片段。如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状， 不形成单带。

32 转基因材料外源基因的检测 转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子 1 2 3 4 5 6 7 8
1,标准分子量；2，质粒；3，对照；4-8，转基因植株

33 3. PCR相关技术 原理：PCR产物－限制性内切酶切－多态性分 析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。
(1) PCR-RFLP: 多聚酶链反应(PCR)--限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP) 原理：PCR产物－限制性内切酶切－多态性分 析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。 优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好， 简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析 与比较, 微生物的分群分型分亚型，癌基因 分析，遗传病的诊断等。 局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变 的情况下，一次只能完成一个特定位点突变 筛选，检测效率低。

34 PCR-RFLP原理示意

35 （2）PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性
(single strand conformation polymorphism) 原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。 刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速。

36 聚合酶链反应一单链构象多态性 （ PCR-SSCP）示意

37 优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、
不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。

38 （3）PCR-southern blot及Dot blot技术：
优点：可以直接检测基因的点突变，缺失及重排，比PCR产物EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高103以上，由于非放射性同位素标记的探针的应用，使得PCR-southern blot应用更简便，现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病 原体特异基因等方面的研究及检测。

39 PCR-Dot blot即是将PCR扩增产物变性后直接点在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。
优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可 同时检测多个样品。 局限：只能看到一个斑点，必须小心控制反 应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测 标本做出正确鉴定.

40 （4）不对称PCR（asymmetric－PCR） 直接测序法
原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核 苷酸引物，引物量相差100倍，通过PCR扩增 获得单链DNA，然后利用双脱氧法直接测序。 应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群 体中某一特定基因的序列变异情况，这种方 法是了解目的基因突变的较理想的方法。

41 (5) 原位PCR技术 原理：即聚合酶原位扩增技术。将PCR技术 与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织
的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原 位研究基因变化的技术。 dNTP--荧光素 PCR扩增 固定组织 蛋白酶K消化 或dNTP-地高辛 -生物素 或荧光染料－抗地高辛抗体 －抗生物素抗体 显微镜观察

42 优点：提高了杂交的灵敏度，又能直接显微 观察病变部位，且标本不需特殊处理或制备， 比较省时和经济，尤其对形态学研究具有其 它方法难以比拟的独到长处。 应用：原位PCR自创立以来，已经在神经性 疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得 到广泛应用。

43 （6）RT-PCR( reverse transcriptase-PCR)
原理：mRNA反转录后进行PCR扩增。实际上 是检测基因表达产物的方法。 优点：灵敏度高，可在106个正常细胞中检 测出1个白血病细胞。

44 4. 基因芯片技术检测基因突变 基因芯片（gene chips) DNA芯片 (DNA chips)
DNA微阵列（DNA microarray) 将数以万计的DNA探针按照一定的顺序排列固化 于支持物表面上，产生二维DNA高密度的分子探 针阵列，然后与标记的样品进行杂交，再利用计 算机控制的信号产生、识别及图象处理系统进行 结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地 检测。 基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料 科学、微加工技术、光学检测技术、计算机技术 等多学科相互结合的产物。

45 通常是荧光标记 硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物 带标记样品 DNA或mRNA的准备 DNA方阵的构建 芯片制作 PCR扩增 二维DNA高密度 的分子探针阵列 分子杂交 杂交图谱的检测和分析 生物样品快速、并行、高效地检测 计算机控制的信号产生、 识别及图象处理系统

46 DNA芯片 基因芯片突变检测原理示意

47 应用：突变检测，基因测序，DNA重排，多态分析，基因表达，克隆选择，文库筛选，病源诊断，药物筛选等

48 其他： 与PCR相关的技术：多重PCR (multi-PCR)、巢式PCR（nested-PCR)，长PCR(long-PCR),定量PCR (quantification PCR)，等位基因特异性 PCR(allele specific PCR, ASPCR)， 酶联免疫PCR(ELISA-PCR)等 2. 限制酶切片段长度多态性组织配型技术 3. 连接酶链反应技术(ligase chain reaction LCR) 4. 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis) 5. 抑制消减杂交(SSH)等

49 谢谢 请多指教