实验十三 组织培养与病毒的 细胞感染法 练习内容 1 .鸡胚纤维母细胞培养法(示教) 2 .病毒的空斑形成试验(示教) 3 .致细胞病变作用的观察(示教)

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实验十三 组织培养与病毒的 细胞感染法 练习内容 1 .鸡胚纤维母细胞培养法(示教) 2 .病毒的空斑形成试验(示教) 3 .致细胞病变作用的观察(示教)

目的要求 1 .了解细胞培养的原理与方法 2 .了解病毒空斑形成试验方法与意义 3 .了解病毒对细胞致病变作用的类型。

一、单层细胞培养法 (一)鸡胚纤维母细胞培养法 (二)人胚肾细胞培养法 二、人双倍体细胞培养法 双倍体细胞株,是一种能在体外分裂 50 代左右而 — 直保持其双倍染色体的单 层细 胞,人双倍体细胞来源可以是人 胚肺( 4 个月以内的胎儿)或人胚肾

三、传代细胞培养法 传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的 单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双 倍 体细胞转化而来,实验室常用从人瘤细胞建 立起来的传代细胞如 Hela 细胞, KB 细胞、 HEP—2 细胞已广泛地应用于病毒实验。这些 传代细胞系的最大特点是通过规律地间 隔传 代,可以无限制地传下去,如果将它们悬浮 四、器官培养

五、病毒的细胞感染法 在单层 细胞上测定病毒的方法有多种, 常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑 形成抑制试验. 六、细胞致病作用的观察 细胞致病作用也称 “ 细胞病变作用 ” ( Cytopathic-effect , CPE ),根据病毒 和感染细胞的不同,细胞病变作用大致 上可以分不同三个类型。

(一)全变型 指整个细胞都发生改变,常表现为( 1 )细胞 核及整个细胞都发生肿胀,胞浆呈颗粒样变 性、胞膜边缘不整齐,或( 2 )整个细胞发生 碎裂、皱缩、变圆、脱落。 (二)包涵体型 有的病毒可在胞核或胞浆内形成包涵体(见 表 13—3 )。 (三)融合型 有的病毒(如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等) 可使多数病变细胞间相互发生融合而呈 “ 巨 细胞 ” (但各个细胞的胞核仍可分辨)。

【结果观察】 纵观整个单层细胞,以下列符号表示其病变 程度: (-) — 无细胞病变; ( + ) —25 %以下的细胞有病变作用; ( ++ ) 一 50 %的细胞有病变作用; ( +++ ) 一 75 %左右的细胞有病变作用; ( ++++ ) 一 75 %以上的细胞有病变作用;

某些病毒引起细胞病变的主要特征 ( 表 13—2 )

实验十四 病毒的血清学试验 血清学试验的方法很多,一股实验室最 常用的是中和试验,补体结合试验和红 细胞 凝集及凝集抑制试验。近年来免 疫荧光技术、免疫酶联吸附技术、间接 红细胞凝集试验、 琼脂扩散试验以及 红细胞吸附抑制试验等技术,也成为实 验室病毒诊断的常规技术。

练习内容 1 .病毒的血球凝集试验 2 .病毒的血球撬集抑制试验

目的要求 1 .了解病毒的血清学试验方法与原理 2 .掌握病毒的血凝试验和血抑试验的 方法与结果判读 血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病 毒的重要手段,也是研究病毒的基本方 法之一。

三、病毒的血球凝集与血球凝 集抑制试验 某些病毒(如流感病毒、副流感病毒、腮腺 炎病毒、脑炎病毒等)能选择性地凝集个别 动物的红细胞,这种现象称为红细胞凝集现 象,简称血凝现象,见表玉 14 一 4 。当这些病 毒与相应的抗体发生特异性结合后,失去了 与红细胞凝集的能力,称为红细胞凝集抑制。 红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结 合试验操作简单、快速、节约、并且血凝抑 制试验具有敏感性高,特异性强的优点. 这里 我们以新鸡城瘟病毒 NDV 为例介绍血凝和血 凝抑制试验。

【材料】 新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液 1 份 0.5 %鸡血球悬液 1 管 生理盐水或 PBS 1 瓶 96 孔微量血清盘 1 块 微量稀释棒 1 支 无菌试管 1 支

【方法】 1 .在微量血清盘的末孔标记为对照孔。 2 .各孔中加生理盐水 25 微升。 3 .取病毒鸡胚尿囊液(经离心) 0.1 毫升加 入无菌试管,然后加生理盐水 0.9 毫升(即 1 ∶ 10 稀释)。 4 .取 1 ∶ 10 病毒稀释液 25 微升加入第 1 孔,再 吸 25 微升置 2 孔,用微量稀释棒捻转 20 次 …… 依次稀释,直至第 9 孔弃去 25 微升。 5 .各孔中加 0.5 %鸡红血球 25 微升充分摇匀。 6 .置室温经 30 分钟, 40 分钟, 1 小时各观 察一次结果。以 45 分钟为准。

新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺 序 ( 表 14-5 )

25 孔 列 病毒稀 释度 1 ∶ 101 ∶ 201 ∶ 401 ∶ 801 ∶ 1601 ∶ 3201 ∶ 6401 ∶ ∶ 2560 对照 生理盐水( μl ) 25 1 ∶ 10 病毒悬液 ( μl ) 25 — 弃去 % 鸡红血球 ( μl ) 25 摇匀后,置室温静止 30—50 分钟

【结果判读】 各孔出现的血球凝集程度以 +++ 、 +++ 、 ++ 、 ++ 、 + 、 — 表示。 ++++ 为全部血球发生凝集,呈颗粒状薄膜 铺于孔底; +++ 约有 50 %血球发生凝集; ++ 约有 50 %血球发生凝集; + 约有 25 %血球发生凝集; — 不凝集,表现为血球沉于孔底,呈一致 密小点,边缘光滑,圆润。 血凝试验的结果以 50 %血球凝集( ++ )的 最高病毒稀释度为试验的血凝滴度,即为 1 个 血凝单位。

血球凝集抑制试验 【材料】 除血球凝集试验所用材料外,血清取 鸡免疫血清。

【方法】 1 .血凝素单位的配制和调配 2 .住微量血清盘上编号,并设血清对 照、病毒(血凝集)对照和血球对照 孔.然后 2—11 孔中各加生理盐水或 PBS25 微升。 . 3 .将 1 ∶ 10 血清加入 1 、 2 、 9 孔,并从 第 2 孔起作一系列倍比稀释至 1 ∶ 1280 或更 高的稀释度,每孔为 25 微升。 4 .按操作简表加入 4 单位血凝集。

6 .混匀,在室温下作用 20 分钟。 7 .各孔中滴加 鸡血血球悬液 50 微升。 8 .在血清对照、病毒(血凝素)对照,血球 对照孔中滴加生理盐水或 PBS 各 25 微 升。 9 .混匀后,在室温下静止, 30 分钟, 60 分钟 各观察一次结果。一般以 60 分钟结果为准, 但如果血球下滑显著,则以 30 分钟结果判读。

血清稀 释度 1 ∶ 101 ∶ 201 ∶ 401 ∶ 801 ∶ 1601 ∶ 3201 ∶ 6401 ∶ 1280 血清 对照 病毒 对照 血球 对照 生理盐水( μl ) NS2550 稀释的血清( μl ) 25 弃去 — — 4 单位血凝( μl ) 25 — — 摇匀后,置室温静止 30—50 分钟 0.5% 鸡红 血球( μl ) 0.5

1 .根据各孔血球凝集程度,以 “++++ 、 +++ 、 ++ 、 + ,- ” 表示。 2 .查看各对照孔:血清对照不凝集(-): 病毒对照为完全凝集( ++++ ),血球对照则 应不凝集( — )。 3 .以出现完全抑制血球凝集(即不凝集) 的最高血清稀释度为其最终滴度。例如 稀释倍数: 1 ∶ 10 l ∶ 20 1 ∶ 40 l ∶ 80 1 ∶ ∶ 320 l ∶ ∶ 1280 结 果: - - - - - 此血清血凝抑制滴度为 1 ∶ 160 ,结果判读】

实验十五 病毒的快速诊断 目的要求 1 .初步掌握电镜下病毒的基本形态 2 .了解 ELISA 的原理、方法及结果判 读

练习 ELISA

酶联免疫吸附试验 ( Enzyme Linked immunosorbent assay , ELISA ) ELISA 是当前各实验检测抗原抗体最常 用的方法之一,也是进行病毒快速诊断 的重要手段。它具有灵敏度高( 10 - 9 一 10 - 12 克),特异性强、操作简便、易于 观察、便于现场大规模检查。

ELISA 的种类有许多种,但用于病毒快 速诊断常用间接法和双抗体夹心法

(一)间接法( indirect method ) 1 .抗原包被 纯化抗原用 pH9.6 碳酸盐缓冲液 适当稀释后,在微量凹孔板上,每孔加 100 微 升,置湿盒中 4 ℃过液,洗涤三次。 2 .加待捡血清 每孔加 100 微升适当稀释的 待检血清,置湿盒中, 37 ℃ 2 小时。洗涤三次。 3 .加酶结合物 每孔加 100 微升酶标记抗人 Ig , 置湿盒中, 37 ℃ 2 小时。洗涤三次。 4 .加底物 每孔加底物 100 微升,置湿盒, 37 ℃ 30 分钟。 6 .加终止液 100 微升。 6 .读取结果。

(二)双抗体夹心法( Double antibody sandwich method ) 1 .抗体包被 已知抗体用 pH9.6 碳酸盐缓冲液 稀释至 1—10 微克/毫升,在微量凹孔板上, 每孔加 100 微升包被,置湿盒 4 ℃过夜。洗涤三 次。 2 .加待检标本 每孔中加含抗原的待检标 本 100 微升置湿盒 37 ℃小时。洗涤三次。 3 .加酶结合物 每孔加酶标记的特异性抗 体 100 微升置湿盒 37 ℃小时。洗涤三次。 4 .加底物 5 .加终止液 6 .读取结果

【结果判读】 用酶标测定仪测在 492nm 下各标本光 密度 OD 值。 ELISA 的结果易受到各种因素影响,因 此每次试验(每一块试验板)都设阳性 对照,阴性对照、稀释液对照、阳性对 照 OD 值 ≥1.0 ,阴性对照 OD 值 ≤0.2 ,结 果用 P / N 值表示。 P/N 值 者为可疑 P / N 值 <1.5 为阴性 P / N 值 ≥2.1 者为阳性