吸光光度法的应用 一、微量组分的测量 四、络合物组成的测定 五、酸碱离解常数的测定 二、示差分光光度法 三、光度滴定法 六、双波长分光光度法

一、微量组分的测量 1. 单组分的测定 A-c 标准曲线法

例 1 水中六价铬的测定 例 1 水中六价铬的测定 国家标准（ GB ）采用二苯碳酰二 肼分光光度法测定六价铬。 在酸性条件下，六价铬与二苯碳酰二肼反应生 成紫外红色络合物， λmax ＝ 540 nm ， ε ＝ 2.6×104~4.17×104 L·mol-1·cm-1 。 举 例

例 2 维生素 B 6 注射液的测定 维生素 B6 在 290 ± 1 nm 处有最大吸收，药典采用 紫外可见分光光度法测定维生素 B 6 注射液。测量 在 0.1 mol·L -1 HCl 介质中进行，按 计 算维生素 B6 的含量。

例 3 蛋白质在 280 nm 处有最大吸收，可 用于蛋白质的定量测定。 例 4 氨基酸与茚三酮反应生成红色络合物， 可用于氨基酸含量的测定。

2. 双组分的测定 同时测定一种试样中的多种组分的基础： 是吸光度具有加合性，即总吸光度为各个组分 吸光度的总和。

设试液中含有两种吸光物质 X 和 Y ，其吸收光谱互相重叠， 根据吸光度的加合性，得 ε 为物质得特征参数，可通过配制标准测得 解联立方程，可求得 c X, c Y 。

1. 将 0.376g 土壤样品溶解后定容至 50mL 。取 25mL 试液进行处 理，以除去干扰元素，显色后定容至 50mL ，用 1cm 吸收池在 510nm 处和 656nm 处分别测得吸光度为 和 ，计算土 壤样品中钴和镍的质量分数。已知 M(Co)=58.93 ， M(Ni)=63.55 。 例题 /nm 510nm656nm /nm 510nm656nm  Co 3.64× ×10 3  Ni 5.52× ×10 4 钴和镍的配合物有如下数据 :

解：已知 b=1cm ，由公式 A=  bc 和吸光度的加和性， 可得联立方程组： A510= A656= 即 解得 =9.70×10 -6 (mol·L -1 ) =2.06×10 -5 (mol·L -1 )

土壤样品中 Co 和 Ni 的含量计算如下： =0.015% =0.032%

二. 示差分光光度法 常规分光光度法只适用于微量或痕量组分的测定， 而不适合常量组分 (2~5%) 。 原因： 当被测组分含量高时，常常偏离朗伯 - 比耳定律。即使不偏离， 由于吸光度太大，也超出了准确读数的范围，就是把分析误差控制在 5% 以下，对高含量成分也是不符合要求的。 若采用示差法，可以提高测量的准确度。

1. 方 法 常规法：以空白试剂（ c=0 ）为参比 示差法：以浓度为 c s 的标准溶液为参比 ( c x >c S 时，适宜高浓度的测定 )

2. 示差法的误差 方 法 定 量误 差 常规法 示差法 因 I 0 >I S 故 Tr>Tx 有 结 论：示差法提高了准确度

1. 已知 ST ＝ 0.01, 样品 Tx = 2.00 ％，标准 TS = 10.0% 例 题 示差法 常规法误差 示差法误差 结论： 示差法提高了准确度

2. 已知 ST ＝ 0.01, 样品 Tx = 2.00 ％，标准 TS = 5.00% 3 、例题

3. 提高测量准确度的实质 示差法相对于常规光度法来说，提高测量准确 度的原因是扩展了读数标尺。

4. 示差法仪器构造的要求 原因： 示差光度法需要一个发射强度较大的光源，才能将 高浓度参比溶液的 A 调至零。 采用专门设计的示差光度计，这就使其 应用受到了一定限制。

1. 用一般光度法测 mol.L -1 锌标液和含锌的试 液，分别测得 As = 和 Ax =1.00 ，两溶液的透 光度相差多少？若用 mol.L -1 锌标液作参比， 试液的 A 为多少？示差光度法与一般光度法相比，读 数标尺放大了多少倍？ 例题

三、光度滴定法 光度滴定法是依据滴定过程中溶液的吸光度的突变来确 定滴定终点的滴定分析方法。 例, 滴定反应 M + R = MR 随着 R 的加入， [M] ↑ [MR] ↑, 滴定曲线随各物质的吸收性质的不同而不同。

四、络合物组成的测定 1. 摩尔比法 2. 等摩尔连续变化法

1. 摩尔比法 在一定条件下，假设 (M) 金属离子与络合剂发生显 色反应： M + nR = MR n 为了测络合比 n ，可固定 c M ，改变 c R 测定方法： ①固定 c M ，改变 c R ②配一系列 c R /c M 不同的溶液 ③在 max 处，测 A ④以 A—c R /c M 作曲线

图 3-3 摩尔比法 适应范围： 适应范围：此法适用于离解度较小，配位比高的配合物组成 的测定，当离解度较大时，因无明显转折点，不能准确测定。 ① 曲线 OB 段代表显色反应尚未进行完全的阶 段，此时 c R /c M < n ，故 A 随 c R ↑ 而增加。 ② 理论上，当 M 与 R 按化学反应剂量关系定量 完全作用时， A 应达到曲线最高点 E 所对应的值。 ③ 继续增加 c R ，由于 M 已全部生成了相应的 络合物， A 基本保持不变，即 CD 直线 ④ 显然，曲线的转折点 E ，所对应的 c R /c M = n ⑤ 找 E 点：由 BC 弧线可画切线外推找交点，即 为 E 点。

2. 等摩尔连续变化法 测定方法： ①保持 c M 和 c R 总浓度不变；即： c M + c R = 常数； ②连续改变 c R 与 c M 之比，配制一系列显色溶液； ③在 max 处，测Ａ。 ④ ⑤曲线转折点所对应的 c R /c M 值，即为ｎ

图 3 － 4 连续变化法 此外还可以测定络合物的不稳定 常数。 当络合物很稳定时，曲线的转折 点明显，而络合物的稳定性稍差 时，可画切线外推找出转折点。 适应范围： 适应范围：适用于配位比低，稳定 性高的配合物组成的测定。

五、酸碱离解常数的测定

某有机化合物的酸性官能团或碱性官能团是发色团的一部 分，则该物质的吸收光谱随溶液 pH 值而改变，不同 pH 时获得不同 A 。 HB ⇌ H + + B - 1. 原 理

配制三种分析浓度 (c =[HB]+[B - ]) 相等而 pH 不同 的溶液。 2. 测定方法 下面以一元弱酸解离常数的测定为例介绍该方 法的应用。

第一种溶液 pH 在 pK a 附近，此时溶液中 HB 与 B - 共存，用 1cm 的吸收池在某一定的波长下，测量其吸光度：

第二种溶液 pH 比 pK a 低两个以上单位的酸性溶液，此时弱酸几乎 全部以 HB 型体存在，在上述波长下测得吸光度：

第三种溶液 pH 比 pK a 高两个以上单位的碱性溶液，此时弱酸几 乎全部以 B - 型体存在，在上述波长下测得吸光度 :

推 导 上式即为用光度法测定一元弱酸解离常数的基本公式。 A 为式中所示的 pH 时溶液的吸光度。 将上各式整理得：

六、双波长分光光度法 2 1 A XY ∵ ∴ Y 的存在不干扰 X 的测定 光源光源 光源光源 单色器 检测器 切光器切光器 狭缝狭缝 吸收池吸收池

问题 1. 双波长法与常规参比法比较，有什么特点？ 2. 如何借助于双波长法消除干扰？ 光源光源 光源光源 单色器 检测器 切光器切光器 狭缝狭缝 吸收池吸收池

六、双波长分光光度法 2 1 A XY ∵ ∴ Y 的存在不干扰 X 的测定 光源光源 光源光源 单色器 检测器 切光器切光器 狭缝狭缝 吸收池吸收池

问题 1. 双波长法与常规参比法比较，有什么特点？ 2. 如何借助于双波长法消除干扰？ 光源光源 光源光源 单色器 检测器 切光器切光器 狭缝狭缝 吸收池吸收池

问题 1. 双波长法与常规参比法比较，有什么特点？ 2. 如何借助于双波长法消除干扰？ 光源光源 光源光源 单色器 检测器 切光器切光器 狭缝狭缝 吸收池吸收池