男性不育的实验室诊断及评估 南京医科大学生殖医学重点实验室 周作民

维持男性生育的基本条件： （ 1 ）睾丸内产生足够数量的精子。 （ 2 ）精子在男性生殖管道内获得运动能力和 受精能力，既精子的成熟。 （ 3 ）输精管道通畅。 （ 4 ）具有正常的性功能。 （ 5 ）附属性腺功能正常。

不育症诊断的步骤： 1. 病史采集 : 包括年龄、职业、生育史、疾 病史、家族史等。 2. 体格检查：包括外生殖器和全身体检。 3. 实验室诊断 4. 特殊检查

一、 精液常规分析 ┌ 精子（ 5% ） 精液组成 ┤ ┌ 精囊腺液（ 60% ）－凝固因子、果糖 └ 精浆（ 95% ） ├ 前列腺液（ 20% ）－液化因子 ├ 尿道球腺液（ 3% ） └ 睾丸液、附睾液 —— 精子

精液分段成分： 前段－睾丸液，附睾液（精子），尿 道球腺液 中段－前列腺液 后段－精囊腺液

精液变量的参考值： 精液量： 2 ～ 6ml 颜色：灰白 液化时间： <60 分 粘稠度：拉丝 <2cm pH ： 7.2 ～ 8.0 活率： >60% 活力： A+B>50% 或 A>25% 精子计数： >2000 万 /ml 畸形率： <30% 脓细胞： < 5 个 /HP （ <1×10 6 /ml)

精子活力分级 A 级：快速前向运动 B 级：慢或呆滞的前向运动 C 级：非前向运动 D 级：不动

影响精液常规数据准确性的因素： ① 自身的波动性 : 要求首次检查应连续进行两次, 间隔时间 7 天 —3 周，两次结果差异大时应再检一次。

每周测定一次精子密度，连续 120 周，期间此人未服 药，也无发热，结果显示精子密度可有显著性波动 。

② 禁欲时间： 要求 2 －７天 ③ 采精方式： 要求用手淫法或取精器取精。 ④ 盛精容器： 要求用对精子无毒性的玻璃或塑料容器。 ⑤ 室温： 要求不低于 20 度 ⑥ 观察时间： 要求精液液化后，取精后 1 小时内检测。 ⑦ 检测设备： 冬天检测应注意保温。

精液常规异常的分析 ： 1. 精液量异常 1) 无精液症：精液量 <0.5ml 或无 病因：①性交不射精 ②逆行射精 2) 少精液症：精液量为 0.5 ～ 2ml 病因：①性交频率过高 ②附属性腺先天性发育不良 ③附属性腺感染 ④雄激素水平下降 ⑤年龄因素 3) 多精液症：精液量 >6ml 病因：①附属性腺感染 ②附属性腺功能亢进

2. 精液液化及粘稠度异常 ① 精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流动性大。 病因：精囊腺炎症 ② 精液不液化或液化不全：液化时间 >30 分 病因：前列腺功能障碍

3. 精液 pH 异常 ： 测量方法： pH 试纸 (pH 范围 或 ) ① pH 过低： pH<7.2 原因：①输精管和精囊腺的缺如 ②附睾病变 ② pH 过高： 原因：①精囊腺液分泌过多 ②前列腺液分泌过少

4. 精子记数异常： 正常 ≥20×10 6 个 /ml 测定方法：①血球计数板 ②一次性精子计数板 ③ Makler 精子计数板 ④ CASA 仪 1) 少精子症： <20×10 6 个 /ml 严重少精子症： <5×10 6 个 /ml 2) 无精子症：精液须经离心，沉淀物中仍未见精子者，并须 连续检查三次尚可确诊。 3) 多精子症： >250×10 6 个 /ml

5. 精子畸形： 观察方法：①吉姆萨染色法或瑞士染色法 ②巴氏染色法 ③布赖恩－利什曼染色 ④肖尔染色法 畸形分类：①头部畸形：大头，小头，锥形头，梨形头， 无定形头，空泡样头，双头等。 ②颈和中段畸形：缺尾，弯曲尾，肿胀，过薄等。 ③尾部畸形：短尾，多尾，断尾，卷尾，双尾等 ④胞质残余体：常位于精子颈部

６．白细胞检查： ① 正甲苯胺蓝过氧化酶染色法： 结果：白细胞染成棕红色 ② 联苯胺法：染料：联苯胺＋玫瑰红 结果：白细胞－褐色；其它细胞－品红色。

二．精子运动特性的检测和分析 1. 显微镜观察： 注意事项： (1) 取精液 10 ul ，滴于玻片，盖上 22×22 盖玻片，静置 1 分钟后观察。 (2) 控制温度，最好在 37 ℃进行 (3) 每次观察 4 ～ 6 个视野，计算 100 个细胞，计算 A 级、 B 级、 C 级和 D 级精子的百分比，连续观察两张滴片， 误差不得 >10% 。

2. 多点曝光技术：在 1 秒钟内对精子连续曝光 6 次，可判 断精子的运动速度及运动轨迹。 精子运动速度分布： 快速： ≥ 25 微米 / 秒 中速： 10—25 微米 / 秒 慢速： <10 微米 / 秒

3. 计算机辅助的精子分析系统（ CASA ） 原理：用高分辨率摄像机实时记录精子及精子运动图象， 用分析软件对图象进行处理和分析，并得出结果。 硬件：显微镜，摄像机，微机 软件：图象分析系统

参数及意义： 1) 运动精子密度：①活动率 ②前向运动率 2) 活力参数：①平均路径速度 ②曲线速度 ③直线速度

不足之处： ① 价格高 ② 误判多：特别是脱落细胞多时 ③ 不能识别畸形精子、脓细胞 ④ 对待检标本的精子密度有一定要求：精子数量少时， 计数偏高，精子数量高时，活率偏高。

４．宫颈粘液穿透试验： 1) 体内试验：性交后试验（ PCT ） 注意事项：①排卵期进行 ②禁欲至少 2 天 ③最好在性交后 9 ～ 24 小时进行观察。 诊断标准：正常为宫颈粘液中的活动精子数 >50 个 /HP 或 A 级精子 >20 个／ HP

影响因素：①女方的内分泌状况。 ②宫颈粘液中的白细胞。 ③阴道 pH ， 8.5 可导致 PCT 异常。 ④宫颈结构异常。 ⑤抗精子抗体影响。 ⑥性功能异常, 如阴道痉挛。 ⑦精子质量差。

2) 体外试验： ① 玻片试验 ② 精子－宫颈粘液接触试验 ③ 毛细管试验 : 穿透介质 : 人宫颈粘液 ; 宫颈粘液代用品 : 牛宫颈粘液 ; 含人血清精子营养液 ; 含牛血清白蛋白精子营养液 ; 鲜鸡蛋清 ;

５．精子顶体酶测定（明胶膜法）： 1) 制备 5% 明胶溶液，吸取 100ul 均匀涂于载玻片上，自 然干燥， 4 ℃湿盒备用，使用前用甲醛－酒精固定液固定 60 分钟。 2) 精子处理：取液化精液，用 PBS 稀释至 2 ～ 4×10 6 个 /ml 。 3) 涂片：取 1 滴精液涂于明胶膜上， 37 ℃湿盒 2 小时。 4) 观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精 子的平均反应直径。 5) 正常值：平均反应率 ≥65% ，平均反应直径 ≥25μm 。

6 ．去透明带仓鼠卵穿透试验 1) 精子准备： ① 精液充分液化 ② 调整精子浓度至 10×10 6 个 /ml ③ 精子获能：取精液 0.5ml ， 5%CO 2 ， 95% 空气中， 37 ℃孵育 18 ～ 24 小时，调整精子浓度至 4×10 6 /ml 。

2) 卵细胞准备： ① 取动情第一天仓鼠，腹腔内注射 PMSG 30 ～ 40U ， 48 ～ 72 小时后再次注射 HCG 30 ～ 40U ， 18 小时后输卵管内取卵。 ② 1% 透明质酸去除卵丘细胞， 0.1% 胰蛋白酶去除透明带。 3) 体外受精： 将 0.1ml 精液加至液体石蜡下，再加入 20 ～ 30 个仓鼠卵， 培养 3 小时。 4) 结果观察： 相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算 受精率，正常为 ≥10% 。

三．精液生化指标检测 1. 酸性磷酸酶测定（ ACP ） 原理： P －硝基酚磷酸二钠 ACP →P －硝基酚 测定产生的 P －硝基酚含量，推测 ACP 的活性 正常值： ≥200U ／一次射精 意义：反映前列腺功能

2. 果糖测定：间苯二酚法 原理：果糖＋间苯二酚 加热 → 红色化合物 测定化合物含量 正常值： 0.87 ～ 3.95g/L 意义：反映精囊腺功能与精子供能有关 3. α －糖苷酶测定 原理：麦芽糖 α －糖苷酶 → 葡萄糖 测定葡萄糖含量 正常值： 35.1 ～ 87.7U/ml 意义：反映附睾功能

四．抗精子抗体测定 1. 常用方法： 1) 凝集试验： 原理：大分子或多价抗体如 IgM 或分泌型 IgA 可以在精子 间形成交链，产生精子凝集，观察。 ① 试管－玻片凝集试验（ FramRlin-Dukes ）： 将待检样本与液化的精液混合后，于３７℃孵育１小 时，显微镜下观察，出现３条以上精子头－头、尾－尾或 头－尾连接即为凝集，观察１０个视野，５个以上出现凝 集即为阳性。 ② 圆盘凝集试验（ Friberg ） ③ 凝胶凝集试验（ Kibrick ） 缺点：假阳性高

2) 精子制动试验（ Isojima ）： 原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制 精子的运动能力。 缺点：敏感性差， IgA 的作用常测不出，吸附于精子 头部的 AsAb 作用也常常测不出。

3) 直接免疫荧光试验： 原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后， 如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现 荧光。 优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假 阳性多。 4) 免疫珠试验： 原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面 有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观 察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比， 且可确定吸附部位。 优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较 贵。

5 ）混合抗球蛋白抗体试验（ MAR 试验）： 原理：将精液与包被了 IgG 或 IgA 的乳胶颗粒或红 细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成 混合凝集预示精子表面存在 IgG 或 IgA.

6) 酶联免疫吸附试验（ ELISA ）： 原理：将精子抗原吸附于酶标板上，加入待检样本，如有 AsAb 则吸附于精子抗原上，加入酶标二抗，与 AsAb 结合， 最后加入底物，产生颜色反应。 优缺点：可大规模使用，但有假阳性和假阴性，必须设定 阳、阴性对照。

五．激素测定 六．遗传检测 （一）染色体检查 １．染色体的非整倍体 １）性染色体的非整倍体 精子发生需要性染色体的平衡，即一个 X 和一个 Y ， X 或 Y 的数目异常均可导致精子发生异常。

( 1) 47,XXY 男性（ Klinefelter’s syndrome ），发生率 1 ： 500 ，睾丸发育不 良，精子发生障碍； 46,XY/47,XXY 亦经常发生，伴有无精子或少精子。 (2) 48,XXXY ， 49,XXXXY 表型为女性，阴茎发育不良，隐睾。 (3) 46,XX 男性：由于 Y 染色体的短臂（ Yp11 ）异位到 X 染色体的短臂上 （ Xp22 ）。内生殖器表现型取决于 Yp11 的断裂部位， Yp11 远端（ SRY 附 近）的断裂常导致隐睾、小阴茎、尿道下裂。 (4) 45,X 男性，较少见，为 Y 长臂缺失，短臂异位至常染色体上（ 13,15,22 常见）。 (5) 47,XYY 发生率 1 ： 750 ，活检显示曲精小管受损，生精阻滞于精母细 胞阶段，有时有精子生成。少数人能生育，但胚胎易死亡，或后代有异 常染色体， 45 － 75% 精母细胞带有二个 Y 。 (6) Y － A 平衡异位： Y 长臂远端的异染区（ Yq12 ）转移至端着丝粒常染 色体的长臂上， Y 长臂断裂在 Yq11 上，断裂部位对精子发生的影响较大， 距 Yq11 较近时，精子发生基因受损，致精子发生障碍。断裂距 Yq11 较远 时，精子发生可正常并能生育，但带有 Y － A 异位的很易再断裂而引起不 育，或将异位传给子代，使子代发生断裂而导致精子生成障碍。

2) 常染色体的非整倍体 在不育男子中，常染色体结构异常的发生率是有生育能力 男子的 10 倍。 (1) 男性 Turner 氏综合征（ Noonan 综合症）： 为常染色体显性或隐性遗传病，染色体核型常为 46, XY ， 或 XO/XY 嵌合体。 临床表现：身体矮小，颈蹼，典型的脸部特征，心脏缺陷， 隐睾，无精子或少精子症，血睾酮下降， FSH 和 LH 升高。 (2)21 三体（ Down 综合症）：可生育或不育，多余的一条 21 可影响联会复合体的形成，也可影响性染色体上性泡（ Sex vesicle ）的形成。 (3) １、 3 、 9 、 10 染色体长臂的部分三体或单体可引起性翻转， 性腺退化，生精障碍。 (4) 罗伯逊异位：无精子症患者可见，但常引起严重少精子症。

体细胞和生精细胞内的染色体异常可能不一致。已发现 1 号染色体的非整倍体和 XY 精子的发生率是体细胞的 10 倍， 如用 XY 精子行 ICSI 则可产生 47,XXY 的后代。已有报道， ICSI 的胚胎性染色体非整倍体的发生率高于自然生殖。因 此对行 ICSI 的患者，最好进行精子的染色体分析或植入前 胚胎的遗传分析。

（二）精子发生基因（ Azoospermia factor, AZF ）检测 1. AZF 存在部位： Yq AZF 的重要候选成分： YRRM1, DYS240, DAZ 3. AZF 与精子发生的关系： 精子发生障碍患者中（无精子或精子计数小于 500 万 ／ ml ）约有１０％有 AZF 缺失

4. AZF 的检测方法： (1) 染色体原位杂交法 (2) Southern Blot 方法 (3) PCR 方法：具有迅速、灵敏、操作简便和成本低等特 点，便于临床推广应用，多重 PCR 可同时检测几 AZF 成分。 (4) 单链构象多态性分析（ Single Strand Conformation analysis, SSCP ）检测 AZF 的点突变。 (5) 核苷酸序列测定 (6) 基因芯片技术

5. AZF 检测的意义： (1) 从基因水平揭示精子发生的机制。 (2) 无精子症和严重少精子症患者的病因诊断。 (3) ICSI 的病例选择。 (4) 为基因缺陷男子和男性避孕的分子疫苗研究打下基础。