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2 contents 3.1 细胞工程的基本技术 3.2 植物细胞工程 3.3 动物细胞工程 3.4 单克隆抗体 3.5 核移植与克隆动物 3.6 干细胞 3.7 iPS 技术

3 3.1 细胞工程的基本技术  细胞工程实验室的常见设备  细胞培养的基本方法

细胞工程实验室的常见设施  灭菌锅  电热干燥箱  超净工作台  倒置显微镜  细胞计数板 电热鼓风干燥箱 手提式高压灭菌锅 立式高压灭菌锅 垂直双人双面超净工作台 离心机 光照培养箱 CO 2 培养箱 液氮罐

5  倒置显微镜  细胞计数板 动物细胞培养中用于观察细胞的生长状况及计数。

6 CO 2 培养箱（动物细胞培养） 光照培养箱（植物细胞培养） CO 2 培养箱主要控制模拟活体内环境 相关的 3 个基本变量：稳定的 CO2 水 平、温度、相对湿度。

7  液氮罐（用于冻存培养的动物细胞）

细胞培养的基本方法 —— 无菌操作 细胞工程的所有试验都要求在无菌条件下进 行，要求十分严格的无菌操作。 1 、准备室、接种室、培养室 （紫外线、熏蒸等）； 2 、超净工作台、高压灭菌设备、过滤器； 3 、生物材料的消毒 （酒精、升汞、次氯酸钠等） ； 4 、试验器械、器皿的灭菌 （干热、湿热）； 5 、药品、培养基的灭菌 （湿热、过滤）；

9 —— 细胞培养技术  细胞培养是指动物、植物或微生物细胞在 体外无菌条件下的保存和生长。 ( 微生物培养、 植物细胞培养、动物细胞培养 )  基本步骤包括： 1. 获取原材料及除菌； 2. 配制培养基，对培养基进行灭菌； 3. 接种、培养和传代。

10 —— 细胞融合技术  离体条件下将不同生物或同种生物不同类 型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合 细胞的技术。 —— 单克隆抗体  细胞融合技术的主要过程： ① 制备原生质体（植物）； ② 诱导细胞融合（化学融合剂介导、电融合、 病毒融合剂介导等）； ③ 筛选杂合细胞。

11 —— 核移植  用机械的办法将供体细胞的细胞核转移至另 一个受体细胞（去除细胞核）中，并使这个 重组细胞进一步发育、分化。  —— 克隆羊 Dolly

植物细胞工程 1 几个基本概念 2 组织培养的基本方法 3 快速繁殖技术 4 植物脱毒技术 5 次生物质与植物细胞的大量培养 6 原生质体培养与细胞融合 7 人工种子

13 细胞的全能性 (totipotence) 1902 年：德国植物学家哈伯兰德（ Haberlandt ）就预言，植 物细胞具有全能性，即植物活细胞具有能够发育成为完整植 株的潜在能力。 1943 年，怀特明确提出了 “ 植物细胞全能性 ” 学说：每个植物 细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。  植物细胞的全能性，是植物细胞工程创立的重要理论基础。 1997 年多利羊诞生证明了动物细胞全能性 几个基本概念 *

14 外植体、愈伤组织  外植体：从健康植株的特定部位或组织，选择用于组织培养 的起始材料，称之为外植体。可以是器官、组织、细胞和原 生质体等（如：花粉、茎段、叶片、茎尖、胚等）。  愈伤组织：原指从植物的伤口部位生成的脱分化的薄壁细胞 团。组织培养时, 则指在培养基上从外植体上长出的一团无 序薄壁细胞。它具有再分化成为完整植物体的潜能。 水稻幼胚 水稻愈伤组织 *

15 细胞分化、脱分化、再分化 分化（ diffrentiation) ：细胞的形态、构造和功能发生变化， 如花芽分化，木质部分化，不定胚分化； 脱分化（ dediffrentiation) ：培养条件下使一个已分化的细 胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱 分化； 再分化（ rediffrentiation) ：将脱分化的母细胞再培养成分 化细胞，并且形成组织或器官以及生物体； 水稻幼胚水稻愈伤组织 脱分化 分化出苗 再分化

16 植物细胞培养的培养基 糖（碳源），氨基酸，维生素等 水： 大量元素： K,Ca,Mg,P,S 等 微量元素： Cl,Fe,Mn,B,Zn,Cu,Co 等 无机营养： 蒸馏水或去离子水 有机营养： 生长调节物质： 生长素： 2 ， 4 － D ， NAA ， IAA 等。 促进根的分化 细胞分裂素： 6 － BA ，玉米素，激动素等， 促进芽的分化 天然附加物： 椰乳，酵母提取物，麦芽浸出物等 植物生长所必须的元素： 大量元素（ 9 种）： C 、 H 、 O 、 N 、 K 、 Ca 、 Mg 、 P 、 S 微量元素（ 7 种）： Cl 、 Fe 、 Mn 、 B 、 Zn 、 Cu 、 Mu *

组织培养的基本方法  进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段 ： 1. 材料的准备； 2. 接种与培养； 3. 继代增殖； 4. 诱导分化、生根成芽； 5. 移栽、炼苗成活。 *

18 水稻幼胚 水稻成熟胚 水稻愈伤组织 分化出苗

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快速繁殖技术  植物快速繁殖技术（快繁）：利用组织培养方法将植物体某一 部分的组织小块，进行培养并诱导分化成大量的小植株，从而 达到快速无性繁殖的目的。也称为试管苗繁殖或微体繁殖。 快繁技术最早在兰花工业上获得成功。在 20 平方米的培养室内，最多可容纳 100 万 株试管苗。 *

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植物脱毒技术  是植物快繁的一个分枝  1952 年，法国科学家首次建立了生长点培养 成株的脱毒法，从而开创了防治植物病毒病 的新途径。  对植物病毒病迄今已采用的生物、物理、化 学等多种防治途径均收效甚微，有的毫无成 效。因此，过去人们只能采取拔除并消毁病 株的消极方法。

23 原理  在感染病毒的植株中，病毒的分布是不一致 的。老叶片及成熟组织和器官中，病毒含量 较高，但幼嫩的和未成熟的植物部位（如茎 尖分生组织），病毒的含量较低，而在生长 点约 0.1 ～ 1 毫米时，则几乎不含病毒颗粒。 这是由于病毒的繁殖运输速度与茎尖细胞生 长速度不同所致。在茎尖分生组织中，细胞 繁殖十分迅速，病毒还来不及侵入，因此就 成为植物体相对无病毒的特殊区域。

24  采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的 0.1 ～ 0.5 毫米带 1 ～ 2 个叶原基的茎尖作为外 植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病 毒小植株的技术。  所取的外植体很小，分离难度大，一般在解 剖镜下操作。  马铃薯、洋葱、大蒜、兰花、菊花、康乃馨、 水仙、唐菖蒲、香蕉、苹果、柑橘、葡萄等。

25  华中农大马铃薯脱毒试管苗 evirus2.JPG evirus2.JPG

次生物质与植物细胞的大量培养  次生代谢产物是指生物中一大类并非生长发育所必需 的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器 官组织和生长发育期的特异性。  那些应用价值高，价格昂贵，资源不足，难以进行化 学合成的植物次生物质，用细胞培养生产才会有经济 上的效益。 1956 年，提出工业化培养植物细胞以生产其 天然产物。之后，用此方法生产了紫草宁、 哈尔碱、麻黄碱、人参皂角苷、紫杉醇等。 《本草纲目》中所开列的 1892 种药物中绝大 多数是植物；目前约有 25% 的法定药品来自 植物。

27  第一个商品化的细胞大规模培养的植物是紫草。  1983 年，日本三井石油化学工业公司利用紫草 细胞大规模培养生产紫草宁，最终浓度达 1400mg/L ，宣布把紫草宁作为燃料和药物进行 工业化生产。 在摇床扩大培养的长春花细胞 紫草 我国已经建立了人参、三七、西洋参、三尖杉、紫草、 洋地黄、长春花、丹参、红豆杉等 40 多种药用植物的液 体培养系统，并对长春花、人参、紫草、红豆杉等进行 大规模培养的探索。 长春花

28 红豆杉 红豆杉树皮中提取的紫杉醇对治疗卵巢癌和 乳腺癌有特效。这种物质的碳环结构十分特殊， 难以通过化学合成获得。然而要治好一个卵巢 癌病妇，至少需要 2 ～ 3 棵 60 老龄的此种树的 树皮。这种树属于稀有树种，且生长很慢，若 不断取用的话，很快就要面临濒危的境地。 我国传统药材生物技术产物第一 个商品化的例子：人参，中国药科 大学组培室 人参

原生质体培养与细胞融合  是指将不同来源的原生质 体 ( 除去细胞壁的细胞 ) 相 融合并使之分化再生、形 成新物种或新品种的技术。  可以避开生殖细胞的受精 过程，在亲缘更远的物种 间实现基因转移，创造出 自然界中所没有的新物种。  目前仍以种内和种间的细 胞杂种为主。 显微镜下的细胞融合过程

30 细胞融合的方法  物理法（电）、化学法（化学融合剂）及生 物法（病毒融合剂）。  原理：增加细胞间的粘附、改变膜的通透 性 —— 随机结合、融合  植物细胞融合常用 PEG 法和电融合法。 目前，最常用的植物细胞融合技术，有高国楠建立的使用化学融合剂 PEG （聚乙二醇）的融合技术（ 1974 ），森达和乔默尔曼创立和发展的 电融合技术，以及斯维格（ 1987 ）将电融合与微培养结合起来的技术。

31 植物原生质体融合过程

人工种子  人工种子又称人造种子，这是细胞工程中最年轻的 一项新兴技术。由英国科学家于 1978 年提出的。  天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。  人工种子是由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个 部分组成。

33 体细胞胚  胚不一定从受精卵发育来，尤其在植物 界，往往可以看到未受精的卵细胞或胚 囊细胞、珠心细胞等发育成胚的现象。  由体细胞发育成的类似于合子胚的结构 成为胚状体或体细胞胚，简称体胚。  体胚具有两极性，可从方向相反的两端 分化出茎和根。因此，体胚可以一次性 再生成完整植株。  把体胚包埋在胶囊内形成球状结构，使 其具备种子机能。所以，人工种子是一 种人工制造的代替天然种子的颗粒体， 可以直接播种于田间。 马铃薯人工种子 *

34 包埋介质海藻酸钠  这种物质在 0.1M 氯化钙溶液中可以迅速固化 成透明的小胶球。海藻酸价格低廉，质地柔 软无毒性，还可人为地在其中加入各种营养 物质和生长调节剂，因此是一种，迄今为止 已发现的比较理想的体细胞胚包埋剂。 美国的一个研究组花了近两年时间，从百余种材料中筛选 到目前广泛使用的人工种子包埋介质海藻酸钠。

35 三大难题有待克服  ①许多重要植物还不能培养出大量的高质量的 体细胞胚。  ②现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有 效地防止微生物的腐蚀。  ③人工种子的贮藏有待进一步完善。 目前已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用 还有很大距离。

36 要点  外植体、愈伤组织、体细胞胚、人工种子  植物细胞培养的优点？  植物组织（细胞）培养的基本过程？  植物脱毒技术原理？  植物原生质体如何制备？植物细胞融合的方 法？  植物细胞工程有何应用前景？