第四章 植物组织培养的 基本操作技术

1 器皿、工具的洗涤 要用洗涤剂去掉油脂和有机物；用 1% 左右的 盐酸可将可溶性无机物洗去 对难洗的或太脏的器皿有时要浸泡过 夜 洗后口向下或垂直放置，晾干或烘干备用；带刻 度的器皿不能烘干，急用的？ 污染的一次性消耗品或装有曾污染的培养基或组织 的器皿，要在高压灭菌 后再处理。

洗液的配制 40 克工业用重铬酸钾溶于加热 100 毫升水，冷 却后慢慢加 900 毫升工业用浓硫酸，边加边搅 拌，在玻璃缸或瓷缸中加盖备用。

2 灭菌方法 培养基营养丰富，适合微生物生长，极易污染， 微生物生长大大快于植物学组织，大量消耗营 养 污染微生物还可能大量分泌和排泄一些对植物 学有毒害的物质，使培养的植物组织难以生活 下去

为防止污染，应注意； 不与微生物或病理工 作者共用组织培养工 作区 一但发现污染，立即 将污染的培养物拿出 培养室进行灭菌处理

有菌的概念 凡是暴露在空气中未经处理的物体，曾经接触 过自然水源的物体表面，都是有菌的 菌的特点是无处不在，无孔不入，在自然而然 条件下忍耐力强。生活条件下要求简单，繁殖 力强。 菌：包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微 生物。这些生物个体极小，肉眼看不到。

无菌的概念 经过高温灼热或煮过足够长时间的物体，经其 它物理或化学灭菌方法处理后的物体，有可能 是无菌的。 高层大气、岩石内部、健康的植物动物内部不 与外表面接触的组织内部有可能是无菌的 强酸强碱、化学灭菌剂等是无菌的

杀菌方法 物理方法：高温 湿热（ 分 钟 ） 和干热（ 小时） 高压锅操作加水 放入物品 加热 排除冷空气 稳压 冷却 接种工具、瓶子、滤膜、针头、针管、容器等到 可用这种方法

射线、超声波、微波、滤膜离心沉淀、大量 无菌水反复冲洗等，

化学方法：各种化学药剂 双氧水、来苏水、 升汞、新洁尔灭等 空气的过滤灭菌 超净工作台的工作原理就是 通过不同等级的细菌过滤膜创造一个无菌的空 间

液体的过滤灭菌 使用孔径 0.45 微米或更小的滤膜 1 先对滤膜、细菌过滤器、无菌液收集容器等进 行高温高压灭菌 2 在超净工作台上等培养基冷却至 40 度左右时加 入灭菌后的过滤液，混匀放置备用。 3 不能在培养基温度较高时加入，防止不耐热物 质的分解

接种用具的灭菌 接种服、帽子、口罩的灭菌 塑料器皿 的灭菌

3 植物材料的表面灭菌 接种就是将处理好的无菌的外植体经过无菌 操作放置在灭过菌的培养基上过程 外植体的采集 刷洗 冲洗 表面灭菌 70% 的酒精 穿透菌孢子的能力最强 表面活性剂 1% 吐温 80 或吐温 20 或 Triton-X 其它灭菌剂 灭菌剂对植物也是在毒的，要注意浓度和时间

表 -1 常用外植体消毒剂的性质和消毒效果比较 化合物 应用浓度范围 清除程度 处理时间 /min 备注 次氯酸钠 1%-1.4%* * 市售溶液的浓度通常为 20% （体积分数）；注 “+” 越多表示清除程度越高。 非常有效 次氯酸钙 9%-10% 非常有效 过氧化氢 10%-12% 有 效 溴 水 1%-2% 非常有效 硝酸银 1% 有效 氯化汞 0.01%-0.1% 2-10 满意 抗生素 4-50mg/l 有效

茎尖、茎段或叶片 刷洗 2-10% 次氯酸 钠泡 4-15 分钟 无菌水冲洗 2-3 果实、种子自来水冲洗 分 花药 70% 酒精几秒 无菌水冲洗 2-3 次 10% 漂白粉 10 分钟 无菌水冲洗 2-3 次 根及地下器官 难灭菌 的用 % 的升汞或者 1-2% 的 溴水

4 无菌操作技术 提前准备工作 操作时的注意 外植体接种全过程： 酒精擦拭手 外植体消毒浸泡 器械消 毒 酒精擦拭培养皿 取外植体 修剪外植体 旋转灼烧瓶口 接种 封口

5 组织培养中常见问题解决 （ 1 ）褐化 培养过程中细胞中多酚氧化酶激活后，酚类被 氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性物质会 扩散，使培养基变褐，还会抑制其它酶的活性， 严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变 褐死亡。

1. 植物种类和品种 2. 生理状态 处于幼龄期的植物材料较从成年植株采集的植物材料 褐化程度轻；老熟组织较幼嫩组织褐化程度严重 。 处于生长季节的植物体内含有较多的酚类化合物，所 以夏季时取材更容易发生褐化，冬春季节取材则材料 褐化死亡率最低 注意取材时间和部位

3. 培养基成份 无机盐浓度过高会使某些观赏植物的褐化程度增加；细 胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的 活性，从而使褐化现象加重。 4. 培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多 酚氧化酶的活性提高，从而加速培养材料的褐化程度。 5. 其它原因

防治措施 选择适宜的外植体和培养基 适当降低培养基的无机 盐、降低 PH 值、降低细胞分裂素水平等 连续转移 加抗氧化剂，如抗坏血酸、硫代硫酸钠、牛血清蛋白、 PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 加活性炭 % 加多胺类物质，如精胺、亚精胺

（ 2 ）玻璃化 组培苗含水量过高，茎叶呈透明状、叶片卷曲 等到畸形，不能生根移栽

玻璃化苗的症状表现 试管苗矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气 孔，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明； 叶片皱缩并纵向卷曲，脆弱易碎； 组织发育不全或畸形；体内含水量高，干物质等含量低； 试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成 活率极低，因而繁殖系数低。

原因 植物种类 培养基硬度和离子比例 培养基中激素 CTK 高 环境湿度

措施 适当控制培养基中离子浓度 适当控制培养基中糖和琼脂 的量 适当降低 CTK 和 GA 的浓度 控制好湿度 增加自然光照，控制光照时间 改善培养瓶的气体交换情况 在培养基中添加其它物质

（ 3 ）污染 污染源有细菌和真菌两类 培养基污染的可能性来源：

细菌污染 （ 1 ）现象 在培养材料附近出现粘液状物或混浊的水迹痕 或出现泡沫塑料的发酵状情况 或在培养基中出现浑浊和云雾状痕迹 特点是菌斑呈现粘液状物，通常 在接种后 1-2 天 就可发现

（ 2 ）原因 材料带菌 培养基灭菌不彻底 工作人员的操作：如使用了未经灭菌的工具、呼 吸时呼出细菌、手接触了材料或是器皿边缘使 微生物落入等

（ 3 ）防治方法 手的清洁与灭菌 接种操作中要接几瓶就用 70% 酒精擦拭，工具 要常灼烧灭菌 丢弃污染的一次性消耗品也要先高温高压灭菌 后，减少污染源

真菌污染 （ 1 ）现象 培养基上长霉，接种 3-5 天能发现，有白、黄、 黑色的 特点是污染部位长出不同颜色的霉菌，在接种 3 天后，有时 10 天才能表现出颜色和症状

（ 2 ）原因 通常 是周围环境不清洁或空气污染造成 接种室不清洁，灰尘太多 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿口径太大 操作不慎，如打开瓶塞时使瓶口边的真菌孢子 落入，解开包头纸或橡皮筋时弹起了真菌孢子， 污染了空间

（ 3 ）防治方法 接种室的空气循环灭菌和紫外灭菌要严格 工作台的空气过滤装置要常检查并提前开启 接种时要规范，如去掉棉塞、打开橡皮筋时动 作要轻，去掉瓶塞后瓶子要拿成斜角等。 丢弃污染的一次性消耗品也要先高温高压灭菌 后，减少污染源

思考题 1 植物组织培养中杀菌方法有哪些？即如何 做到各个环节上的无菌？ 2 植物学组织培养中常出现的问题有哪些？ 如何尽量避免之？