中期考核汇报 张 婧 导师：罗深秋教授 时间：2006-03-23
AMP 激活蛋白激酶（AMPK）靶向治疗肝纤维化作用机理的研究 课题名称 AMP 激活蛋白激酶（AMPK）靶向治疗肝纤维化作用机理的研究
肝脏疾病严重危害着人们的健康。 卫生部2005年的统计资料显示： 我国约有1.2亿人携带乙肝病毒，慢性乙肝患者约3000万； 慢性丙肝患者3800万； 脂肪肝患者约5000万； 药物、中毒、自身免疫性肝病患者1000万人。 每年约有50万人死于慢性乙肝相关疾病。
肝纤维化是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化。近年来的研究已经证实肝纤维化是由于肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC)分泌了过多的胞外基质，并在肝脏内沉积而形成的。
肝脏星形细胞(hepatic stellate cells ,HSC) 又称贮脂细胞(fat－storing cell ,FSC) ,具有贮存脂肪供肝细胞能量、贮存及代谢维生素A、合成细胞外基质的功能。在炎症、化学物质等致病因素刺激下HSCs 可活化、增殖并产生大量的胶原,是形成肝纤维化的中心环节。
抗纤维化的治疗策略 去除病因，减少炎症; 抑制HSCs 激活和细胞外基质合成; 促进基质降解； 肝细胞再生； 促进HSCs的凋亡。
近来的研究表明，AMP激活的蛋白激酶（AMPK）持续性的激活可以引发细胞的凋亡 。有实验证明持续的AMPK的活性可以诱导MIN6、原代的β－cell、Jurkat等细胞的凋亡。 香港大学徐爱民教授与伦敦MRC研究中心的 David Carling 博士的合作课题中，对AMPK在激活的大鼠HSCs细胞的功能作用进行了初步的探讨。他们发现腺病毒介导的组成性激活的AMPK的过表达能明显的诱导激活的大鼠HSCs 细胞产生凋亡。
技术路线 HSCs的分离 人肝星状细胞株LX-2的培养鉴定 HSCs的鉴定和培养 腺病毒转染 外源基因表达的检测 细胞凋亡的检测 动物实验
课题进展 分离、鉴定了大鼠的肝形状细胞； 鉴定了LX2细胞 正在摸索合适的病毒感染的数量，以及感染后收获细胞的时间。
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HSCs的分离 CL2MDP质脂体的制备 质脂体尾静脉注射3d 灌注、分离肝脏 纱网过滤、密度梯度离心 培养
HSCs的鉴定 1.Anti－desmin的抗体做免疫组化 2.油红o染色 3.荧光显微镜观察
腺病毒的转染 设置不同的病毒的梯度感染细胞：0、10、20、40、80、100pfu，分别在18h和、30h、48h提取蛋白，进行目的蛋白表达的检测，以确定病毒的用量和收获细胞的时间。
外源基因表达的检测 1.western blotting检测外源基因的表达：用抗Myc-标签的抗体作为一抗检测。 2.免疫组化检测
细胞凋亡的检测 形态学的观察 流式细胞仪的检测 DNA ladder分析 JNK表达的变化 Caspase3表达的变化 Bcl－2表达的变化
动物实验 酒精诱导的小鼠肝损伤 （含乙醇的高脂肪流质食物喂食4周） 四氯化碳诱导的肝纤维化 （腹腔注射四氯化碳6周 ） 动物模型通过尾静脉注入表达组成性激活的AMPK或荧光素酶的重组腺病毒，在预定时间后，取老鼠的肝脏进行以下分析： （1）免疫组化评估肝损伤的程度，炎症灶，HSCs细胞的激活，胶原的含量等； （2）检测参与肝脏炎症和纤维化的关键基因，如TNF，和胶原家族成员的表达水平，通过这一体内实验，以期确定AMPK的激活是否能有效预防和逆转肝纤维化。
分离的HSCs