第十四章 酵母基因工程

酵母应用广泛： 酿酒； 酿醋； 生产酱； 制作面包 培养基成分 基因工程载体

本章内容 酵母基因工程的发展现状 酵母基因克隆载体系统 酵母基因的表达系统 利用酵母基因工程生产乙肝疫苗

酵母基因工程的发展现状 酵母菌的分类学特征 酵母菌基因组特征 酵母菌表达外源基因的优势 酵母基因工程的发展趋势

酵母基因工程的发展现状 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。

酵母基因工程的发展现状 酵母菌基因组特征 1989 年1 月-1996 年1 月，酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae) ，最早的真核生物全基因组测序。 16 条染色体，12052 kb，6135 ORF 。 基因组结构紧密，开放阅读框(ORF s) 占据整个基因组的72%

酵母基因工程的发展现状 酵母菌表达外源基因的优势 生长迅速，约2小时增殖一代，酵母既能以单倍体形式存在，又能以二倍体形式存在，便于进行遗传分析。 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统。

酵母基因工程的发展现状 酵母菌表达外源基因的优势 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定是安全的 酵母基因组小，是最简单的真核模式生物 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。

酵母基因工程的发展现状 酵母基因工程的发展趋势 酵母基因工程还存在许多待完善的地方 向人类基因组计划中的应用研究发展 利用酵母基因工程筛选更多的新药 改造酿酒酵母，降低生产酒精的成本 研究酵母的生理承受极限

酵母基因的克隆载体系统 酵母载体中的调控序列 ARS (auto replication sequence) 2m质粒DNA 酵母着丝粒(centromere, CEN) 酵母的端粒(telomere) 大肠杆菌基因序列 筛选标记:抗性标记、遗传标记

酵母基因的克隆载体系统 酵母克隆载体中的种类 YIp质粒（Yeast integrating plasmid) 整合型质粒 YEp质粒（Yeast episomal plasmid) 附加体型质粒 YRp质粒（Yeast replicating plasmid) 复制型质粒 YCp/CEN质粒（Yeast centiometic plasmid) 着丝粒型质粒 YLP质粒（Yeast linear plasmid） 线型质粒 YAC（Yeast artificial chromosome) 酵母人工染色体

YIp质粒 YRp质粒 YCp质粒 YEp质粒 YLP质粒

酵母基因的克隆载体系统 YAC酵母人工染色体 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在YLP质粒上， 并进行环化，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。 YAC不适用于以生产为目的的基因工程。主要用于人类基因组研究和巨大基因如基因达106bp数量级基因的克隆。

酵母菌的表达系统 酵母表达系统的遗传标记 酵母表达载体系统的特点 常用酵母菌表达系统

酵母菌的表达系统 酵母表达系统的遗传标记

酵母菌的表达系统 酵母表达载体系统的特点 载体的基本构架-穿梭载体 原核部分：大肠杆菌复制的起点序列（ori）、抗性基因序列，如Ampr,Kan等。 酵母部分: 2m质粒DNA；ARS(auto replication sequence)；整合型载体的整合介到区；筛选子（营养缺陷型；抗生素型）；启动子；终止子 信号肽：酵母自身信号肽；异源信号肽

酵母菌的表达系统 酵母表达载体系统的特点 载体的复制形式 附加型： 如2m质粒DNA；转化效率高，复制拷贝数高，但容易丢失。 整合型：不含酵母DNA复制起始区，而含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体同源重组，稳定性好，但复制拷贝数低。

酵母菌的表达系统 酵母表达载体系统的特点 宿主的要求 安全无毒、不致病 遗传背景清楚、容易进行遗传操作 构建的载体DNA容易进入，转化频率高 发酵周期短，培养条件简单，容易高密度发酵 蛋白质分泌能力好 有类似高等真核生物蛋白质翻译后的修饰功能

酵母菌的表达系统 酵母表达载体系统的特点 酵母的DNA转化方法 原生质体法：早期转化方法，现在已不用 离子溶液法：用各种离子（如Cs+、Li+）溶液进行处理，然后进行DNA转化 一步法：在离子溶液基础上，实用于静止期酵母细胞的转化 PEG1000法：PEG处理酵母细胞获得感受态 电穿孔法和粒子轰击法：转化效率高，仪器昂贵

常用酵母菌表达系统 酿酒酵母表达系统 酿酒酵母为最早建立的酵母表达系统，具有较高的安全性，最早用于表达人重组干扰素 1.附加体型载体 大肠杆菌部分： pUC质粒复制起点：ampr选择标记 酵母部分： 2μm质粒复制区；启动子；终止子；分泌信号；标记基因等 这类载体拷贝数高，稳定性低，不适于工业化生产

p280 pGAL1 CYC1TT f1 ori pUC ori 2 μm质粒 Ampr URA3 酿酒酵母附加型表达载体 PGAL1: 半乳糖诱导型启动子；S:分泌信号；CYC1 TT:终止子；URA3:尿嘧啶合成途径中乳清酸核苷5′磷酸脱羧酶基因；2μori:酵母2μm质粒的复制区；ampr:氨苄青霉素抗性基因；pUC ori:大肠杆菌pUC18质粒的复制区；f1ori:f1噬菌体的复制区；kanr:卡那霉素抗性基因

缺乏2μm复制质粒，其它均与附加体型质粒相同 特点:载体的稳定性高，拷贝数低 2. 整合型载体 缺乏2μm复制质粒，其它均与附加体型质粒相同 特点:载体的稳定性高，拷贝数低 酿酒酵母rDNA介导的表达载体 PGAL1: 半乳糖诱导型启动子；S:分泌信号；CYC1 TT:终止子；URA3:尿嘧啶合成途径中乳清酸核苷5′磷酸脱羧酶基因；ampr:氨苄青霉素抗性基因；ColE1 ori:大肠杆菌ColE1质粒的复制区；kanr:卡那霉素抗性基因;rDAN:酿酒酵母的rDNA片段 p281 酿酒酵母表达性载体的缺点是：较难进行高密度发酵；蛋白质的分泌能力差

常用酵母菌表达系统 巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长 迅速。

4.重组菌遗传性稳定，分泌型好，适于大量发酵 载体特点 1.强启动子，甲醇严格诱导 2.能够对重组蛋白进行翻译后加工 3. 蛋白表达量大，相当于酿酒酵母的10-100倍 4.重组菌遗传性稳定，分泌型好，适于大量发酵 5.适于工业化生产和高密度培养 p282 Ampr 5′AOX1 HIS4 pBR322 Kanr 3′AOX1 毕赤酵母整合型分泌表达载体 5′AOX1:乙醇氧化酶基因启动子；S:分泌信号； 3′AOX1 （TT）:乙醇氧化酶基因终止子；HIS4:组氨酸脱氢酶基因； 3′AOX1 ：乙醇氧化酶基因片段；pBR322:大肠杆菌pBR322质粒的复制区；ColE1 ori:大肠杆菌ColE1质粒的复制区； ampr:氨苄青霉素抗性基因； kanr:卡那霉素抗性基因

常用酵母菌表达系统 乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优 于酿酒酵母表达系统。

常用酵母菌表达系统 多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被 发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝， 因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获 得成功表达。

利用重组酵母生产乙肝疫苗 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重 中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。而利用重组酵母大规 模生产乙型疫苗为其防治提供了一定的保证。

利用重组酵母生产乙肝疫苗 乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母

乙型肝炎病毒的结构与性质 乙型肝炎病毒的结构 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒 颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要 结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽。

产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建 转化his-的受体细胞 重组分子 染色体DNA his+的转化子 Bgl II PARS2 Bgl II Bgl II 5’ AOX1 3’ AOX1 转化his-的受体细胞 pBSAG151 HBsAg 11 kb 重组分子 PHIS4 染色体DNA his+的转化子 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1

产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 重组巴斯德毕赤酵母的性能 由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因 AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得 90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。