麩醯胺添加對子癇前症引致之黏著分子表現之影響 Effects of glutamine supplementation on the expression of cellular adhesion molecule induced by preeclampsia 許淳森1 仇思源1 梁守蓉1 張君堯1 邱琬淳2 * 葉松鈴2 # Department of Obstetrics and Gynecology, Wan-Fang Hospital 1, Graduate Institute of Nutrition and Health Sciences2, Taipei Medical University 市立萬芳醫院婦產科部1 臺北醫學大學保健營養學研究所2 前言 子癇前症（preeclampsia）為臨床上常見的妊娠併發症，其症狀包括高血壓、蛋白尿及水腫等。有研究發現，子癇前症的孕婦會有全身性的發炎反應及內皮細胞（endothelial cell，EC）受損的情形，其胎盤可能會分泌過多的細胞激素（包括：IL-1β、IL-6及IL-8等），進而刺激內皮細胞的黏著分子（adhesion molecules）表現增加，造成白血球之滾動、黏著及遷移至組織中，使孕婦及胎兒之氧化壓力增加，造成母體組織之損傷，並會使胎兒發生血管病變、生長遲緩甚至死亡。因此若能降低子癇前症孕婦血管內皮細胞上黏著分子的表現，或是減少白血球遷移到組織中，應可減輕其引致之組織傷害；另外亦有研究發現子癇前症之孕婦其血漿中同半胱胺酸（homocysteine）會升高、一氧化氮（nitric oxide；NO）含量則會降低，亦會影響到EC之功能。麩醯胺（glutamine，GLN）為免疫細胞及腸黏膜細胞之重要能量來源，由於其在體內可以自行合成，故常被忽略其重要性。近來之研究發現，在創傷或是異化性代謝疾病時，血液及骨骼肌中的GLN濃度明顯下降，其下降量的多寡，往往與病患之存活率相關，因此在某些疾病狀況下GLN被認為是一種必需胺基酸。有研究顯示，GLN可以減少腸道中細胞黏著分子（intercellular adhesion molecule-1；ICAM-1）之過度表現；給予老鼠 indomethacin 刺激腸道產生發炎反應時，發現GLN之給予可以減少白血球發生黏著及遷移的現象。因此GLN對於內皮細胞的黏著分子之表現，具有其影響力。目前並無任何研究探討營養素介入對於子癇前症孕婦免疫黏著分子表現、細胞激素分泌與一氧化氮含量之影響，由於EC功能的好壞與否，會影響孕婦及胎兒的健康狀況。因此本研究目的，主要是想了解子癇前症孕婦血漿中GLN濃度是否較正常孕婦低；另外以人類臍帶靜脈內皮細胞為實驗模式，給予GLN介入後，探討子癇前症孕婦血液對於細胞黏著分子、細胞激素及一氧化氮之影響。 四、Fig 3. 結果顯示：IL-8之分泌量隨著時間的增加而增加，但各時間點組間並無差異， 顯示GLN對於HUVEC在以子癇前症孕婦血漿刺激後IL-8之分泌並無影響。過去的研究發現，嚴重的子癇前症孕婦血漿可能會藉由刺激 NO之釋出，進而促進內皮細胞IL-8之分泌， IL-8之分泌也會促進ICAM-1之表現。在本實驗中我們並未觀察到三者之間的相關性，可能是因為內皮細胞無法誘發足夠的NO來調節IL-8之分泌， 至於GLN之添加是藉由何種機制來調節ICAM-1之表現，則有待更進一步之研究。 Fig.1 Effect of pretreatment with different glutamine ( 0, 300, 600, 1000 μM ) concentrations on ICAM-1 expression in HUVEC stimulated by preeclamptic plasma. * p< 0.05 compared with groups at the same time point 材料與方法 一、血液中麩醯胺及黏著分子含量之分析 收集正常孕婦 10名、子癇前症孕婦16名，分析其血液中 GLN、sICAM-1 及sVCAM-1 之含量。 二、人類臍帶靜脈內皮細胞之收集 將人類臍帶靜脈血管以含有collagenase type I（1 mg/ml）之 PBS 灌流20分鐘，沖下之HUVEC 放入含有20% FCS之 M 199培養，再將之繼代培養在含有0.1% gelatine之培養皿中，經過2-3次繼代所得到的 HUVEC，再進入實驗。 三、實驗設計 將不同濃度的GLN（0、300、600、1000 μM）加入 insert中與 HUVEC共同培養24小時，再加入子癇前症孕婦之血漿刺激，每 1.5 小時收集insert上層培養液和 HUVEC供分析（如下圖所示）。GLN 300μM為低生理濃度， 600μM為正常生理濃度， 1000μM則為高濃度。 ○ HUVEC 2×105 0、300、600、1000 μM GLN 24 h 子癇前症孕婦之血漿 進行分析 （1）Insert上層：分析IL-8、NO量 （2）以flow cytometry測量細胞上ICAM-1 表現量 0 1.5 3.0 4.5 6.0 h 0 h Fig.2 Effect of pretreatment with different concentrations of glutamine ( 0, 300, 600, 1000μM ) on nitric oxide released from HUVEC after stimulation with preeclamptic plasma. * p< 0.05 compared with groups at the same time point. 統計方法 數據以 mean ± SD 表示，進行 two-way ANOVA with fisher’s test，p < 0.05表示有統計上的差異。 結果與討論 一、正常女性之血中 GLN平均濃度約為 600μM，由本實驗結果得知正常孕婦血中 GLN濃度略低於未懷孕婦女，而子癇前症患者其血液中 GLN濃度顯著低於正常孕婦組。但黏著分子之含量則在兩組之間沒有統計上的差異。有研究指出在懷孕末期，血漿中 sVCAM濃度，不論在有或無子癇前症均無差異，與本實驗之結果相似。 Fig.3 Effect of pretreatment with different concentrations of glutamine ( 0,300,600,1000μM ) on IL-8 production from HUVEC after stimulation with preeclamptic plasma. * p< 0.05 compared with groups at the same time point. Table 1. Plasma glutamine, sICAM and sVCAM concentrations in pregnant women with or without preeclampsia.　　 結論 本研究發現：子癇前症孕婦血漿中GLN 濃度低於未患有子癇前症之孕婦；且正常生理濃度GLN之添加，可以降低子癇前症孕婦血漿刺激 HUEVC 所引致之 ICAM-1 表現。 * p< 0.05 vs women with normal pregnancy. 計劃編號: 93-TMU-WFH-10 二、Fig. 1 之結果顯示：600 μM GLN之添加，在子癇前症孕婦血漿刺激後4.5及 6小時，可顯著較其他濃度組降低 HUVEC 之ICAM-1 表現。此結果顯示與低生理濃度GLN組相較，培養在正常生理濃度GLN之內皮細胞可降低 ICAM-1之表現量，推測 GLN之添加可能有助於減輕子癇前症引致血管內皮細胞之發炎反應。 參考資料 1. Var A, Yildrim Y, Onur E, Kuscu NK, Uyanik BS, Goktalay K and Guvenc Y. (2003) Endothelial dysfucntion in preeclampsia. Gynecol Obstet Invest 56: 221-224. 2. Daniel Y, Kupferminc MJ, Baram A, Geva E, Fait G and Lessing JB. (1999) A selective increase in plasma soluble vascular cell adhesion molecule-1 level in preeclampsia. Am J Reprod Immunol 41: 407-412. 3. Wang X, Athayde N and Trudinger B. (2004) Maternal plasma from pregnant women with umbilical placental vascular disease not affect endothelial cell mRNA expression of nitric oxide synthase. J Soc Gynecol Investig 11: 149-153. 三、Fig 2. 之結果顯示：NO 之濃度在各組及各時間點上均無統計上的差異。有研究顯示不論有或是無罹患子癇前症之孕婦，其血漿均不會影響內皮細胞上 NOS（NO synthase）之 mRNA表現，因此 NO可能不是影響 EC活化的因子；在本實驗結果發現不論GLN添加之濃度多寡，均不影響 HUVEC 之 NO分泌量， 顯示 GLN降低 ICAM-1之表現並不是藉由調控NO之故。