体外分析

Yalow 1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel奖。

体外分析技术 体外放射分析 非放射标记免疫分析 放射免疫分析（RIA） 免疫放射分析 (IRMA) 受体的放射配基结合分析(RBA) 酶免疫分析(EIA) 化学发光免疫分析(ECLA) 时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)

Radioimmunoassay,RIA 放射免疫分析

Radioimmunoassay,RIA 是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原与定量的标记抗原同有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为微量定量手段，获得待测生物样品中抗原浓度的技术

RIA原理 为了定量地测定待测样品中抗原的含量，如在这个体系中加入放射性核素标记的同类抗原，体系中同时存在两个平衡 Ag＋Ab Ag.Ab Ag* Ag*.Ab

Ag＋Ab ------- Ag.Ab ＋ Ag* -------- Ag*.Ab 当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag之和大于Ab时，则Ag*.Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关系，即随着Ag浓度的增加，Ag*.Ab复合物也减少，因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制

Competive inhibition curve Binding rate（％） Concentration of antigen(mol/L)

Standard curve 如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下进行分析，测得各标准点的结合率(B/F)，以结合率对标准品量作图，可以得到一条标准曲线。通过这条标准曲线即可查得未知浓度的待测样品的含量 结合率 50% 2 4 8 16 32 已知Ag浓度

RIA优缺点 优点： 特异性强 灵敏度高，可检测10-9～10-12 g水平 稳定性好 操作简便 适于多种生物活性物质 缺点：测量的是免疫活性

RIA操作流程 加样 非平衡法：先加抗体、样品或标准品，温育一段时间后再加标记抗原 平衡法：同时加入抗体、标记抗原、样品或标准品 温育 分离游离部分和结合部分 放射性测量 拟合标准曲线并求出样品含量

体外分析的基本技术 (RIA,IRMA) 分离技术 生物样品的制备 标准曲线的拟合 质量控制 标准品 标记品 特异性结合剂

标准品 Standard sample Qualitative request 质的要求 与待测配体属同类物质 与待测配体有同等的活性和亲和能力 纯度高，不含其它杂质、稳定性好 Quantitative request 量的要求 定量精确

标记抗原 Labeled 合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量等） 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好，贮存不易脱标 常用的核素是125-I,半衰期60天

抗体 Specific binding reagent 特异性(specificity)：不受交叉反应的程度 亲和力(affinity)：配体与抗体相互结合的程度，用亲和力常数表示 滴度(titer)：在RIA时，结合50%的标记配体的抗体稀释度；IRMA分析要求较高滴度（过量）

分离技术 固相法：将抗体吸附在某种固体支持物（球、管）上，如塑料、纤维素等材料 双抗法 Ag+Ab AgAb+Ab2 AgAbAb2

生物样品的制备 Preparation of biological sample 应根据不同样品或不同分析方法制备生物样品和贮存样品，避免活性损失 避免反复冻融、溶血、室温保存过长 部分样品测定前需提取、稀释等处理  

标准曲线的拟合方式 标准曲线是衡量待测样品中配体浓度的客观尺度和基准 反映检测质量的指标 标准曲线要最大限度地反映量效关系 便于自动化分析，使用灵活 每一批分析必须做一条标准曲线。

log-logit法 log-logit坐标系及线性回归法： 是目前公认比较好的拟合方法，它是以 结合率的logit值为纵坐标，以标准品浓 度的对数值为横坐标，制成散点图，然 后用最小二乘法对各散点进行直线回归， 得出回归方程，获得标准曲线，可用计 算机或计算器完成

Log-Logist 作图法 logit Y=a+b logit Y=ln(logX/ 1-B/Bo ) a＝截距 b斜率为"-"值 Y＝结合率 Y与X呈负相关 r为负值，接近1表示曲线质量好 logit y log X

数据处理 WHO推荐： 四 五参数Logistic模型

RIA分析误差 系统误差：向一个方向偏离，但可纠正 如标准品不标准、加样器不准等 随机误差：不可避免，但可控制在一定范围 如加样、分离、放射性测量等

质控指标 准确度 精密度 灵敏度 特异性 稳定性 健全性

准确度 指样品的测定值与真值相符合的程度 常用回收率测定或质控血清样品来估计 回收率（％）＝（回收管测定值－对照管测定 值）/回收管加入的已知量×100％ 回收率（％） ＝回收管测定值/（对照管测定 值＋回收管加入的已知量）×100％ 对照管：加入样品 回收管：加入样品和已知量的分析物 回收率一般为90％～110％之间

质控样品 经标定的已知量的待测物样品 与待测样品具有相同的生物活性和免疫活性 分高、中、低三种浓度 WHO推荐使用质控图

质控图

精密度 指同一样品重复测定的一致程度，即测定的重 复性，通常用变异系数CV和标准差SD表示 CV=SD/X RIA中应做复管或三管

灵敏度 用统计学方法能与零剂量相区别的最小量，即 零标准管结合率为X-2SD时所对应的剂量值

特异性 指反应体系不受干扰物质影响的程度，反应的是对反应物测定的专一程度，用交叉反应率表示

稳定性 指在合理的保存条件下，在有效期内保持其全部原有性能不变的能力 Bo% NSB% 回归参数a、b、r ED25、ED50、ED75

健全性 用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致 常借助于标准曲线与样品的稀释曲线是否平行来判断

免疫放射分析 Immunoradiometric assay,IRMA 是以抗原抗体的免疫反应为基础，不同的是放射性核素标记的是抗体，以过量标记抗体直接与待测抗原结合，因此，溶液中放射性与待测物的浓度呈正相关，为非竞争性结合分析

双位点法(Ab2为McAb) 具有代表性的固相免疫放射分析法： 固相Ab1+Ag (固相)Ab1.Ag (过量) + (过量) + 过量Ab*2((McAb) 固相Ab1.Ag.Ab*2 +剩余Ab*(洗去) sandwich Ab1 Ag Ab2*

标记第三抗体法 与双位点法相似，只是两种抗体均不标记，而是反应结束后，加入非特异的125I-第三抗体(兔抗鼠IgG)，与抗原－抗体复合物结合，达到测量结合部分的目的 Ag Ab1 Ab2 Ab3*

RIA与IRMA区别 RIA IRMA 标记抗原 标记抗体 定量抗体和标记抗原 过量抗体和标记抗体 竞争性结合 非竞争性结合 标记抗原 标记抗体 定量抗体和标记抗原 过量抗体和标记抗体 竞争性结合 非竞争性结合 抗原和标记抗原抗体 抗原和标记抗原抗体 复合物呈负相关 复合物呈正相关 灵敏度、特异性更高 待测抗原需有两个抗原 决定簇，故不适于小分 子多肽

受体与配体 受体（receptor）是细胞表面或亚细胞组分中的 一种天然分子，可以识别并特异地与有生物活性 的化学信号物质（配体）结合，并转导信号，引 起特定的生物效应。 配体（ligand）是指这样的一些信号物质,除与受 体结合外，本身并无其他功能，它不能参加代谢 生成有用物质，也不直接诱导任何细胞活性，更 无酶的特点，它唯一的功能就是通知在环境中存 在一种特殊信号或刺激因素。

受体与配体

受体的特点 在组织内特异分布 与相应的配体有极高的识别能力和高度亲和力 与相应配体结合后能引起特定的生物效应

受体与配体结合的基本特征 可饱和性 特异性和高亲和力 可逆性 识别能力与生物效应的一致性

受体的放射配基结合分析RBA RBA测定的基本参数是受体的最大结合容量RT和受体与配体结合的平衡解离常数KD 受体与配体结合反应分为 单位点系统 双位点系统 多位点系统

质量作用定律 [R]+[L] [RL] v1=k1[R][L] v2=k2[RL] 平衡时v1=v2 故k1[R][L]=k2[RL] k1 v1 [R]+[L] [RL] v1=k1[R][L] v2=k2[RL] 平衡时v1=v2 故k1[R][L]=k2[RL] 平衡解离常数 KD=k2/k1 故KD= = = 展开得： [RL]2－[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0 KD和RT是固定的，RL与LT呈曲线关系 图形表现为饱和曲线 k2 v2 [RT－RL][LT－RL] k2 [R][L] k1 [RL] [RL]

饱和曲线

饱和曲线

Scatchard图 KD= = = － 当RT与KD固定时 与RL呈线型关系 [RT－RL][LT－RL] [RT－RL][L] [RL] = － 当RT与KD固定时 与RL呈线型关系 [RT－RL][LT－RL] [RT－RL][L] [RL] [RL] 1 [RL] [RT] [RL] KD KD [L] [RL] [L]

Scatchard图

Scatchard图

Scatchard图的作用 求出受体的最大结合容量RT 受体的平衡解离常数KD 如果Scatchard图不是直线，则提示： 受体可能是双位点或多位点系统 受体有正协同或负协同作用

正负协同作用

双位点系统

非特异性结合（NSB） 受体与配体的特异性结合（SB）的特点是：低容量、高亲和力、易被饱和 RBA实验中，SB是将总结合（TB）减去 NSB而得出 一般可用100～1000倍量的非标记配基取代标记配基与受体的结合（SB）而形成NSB

非特异性结合（NSB）

RBA基本流程 制备标本（亚细胞组分、细胞悬液、冰冻切片） 加样（放射配基、缓冲液、标本、非标记配基等） 孵育（一般要求达到反应平衡） 分离结合和游离的放射配基 测量结合部分的放射性 数据处理或观察切片上的受体分布

标记免疫技术发展方向 放射免疫技术 免疫放射技术 多克隆抗体 单克隆抗体 放射性标记免疫技术 非放射性标记免疫技术

非放射性标记免疫分析技术 Enzyme immunoassay,EIA Chemiluminescence immunoassay,CLIA Time-resolved fluoroimmunoassay,TrFIA 美国拜耳公司化学发光仪

酶标记免疫技术 EIA原理： 酶标记（HRP、AP、GO等） 生成酶标记抗原抗体复合物 相应的酶的底物（如TMB、5-AS） 生成有颜色的产物（如黄色、棕色） 分光光度计测定颜色深浅（OD值）以决定待测含量

经典ELISA 双抗法：测抗原 固相载体＋Ab 固相Ab＋Ag 固相Ab- Ag＋HRP-Ab 固相Ab-Ag-HRP-Ab ＋底 物 颜色反应 分光光度计测定OD 间接法：测抗体 固相载体＋Ag 固相Ag＋Ab 固相Ag- Ab＋HRP-抗人IgG 固相Ag-Ab-HRP-抗 人IgG＋底物 颜色反应 分光光度计测 定OD

化学发光免疫分析技术 经典的CLIA是用发光化合物异鲁米那和吖啶酯为标记物，在碱性条件下遇过氧化物便能发 生单光子发射，光子数量和发光标记抗原抗体复合物呈正比

化学发光酶免疫分析（CLEIA） 标记物：碱性磷酸酶（AP） 底物：金刚烷 测定：发光强度

化学发光免疫分析 碱性磷酸酶 发光 去除游 离部分 ALP标记Ag 或Ab，形成 Ag.Ab反应 温育 光电倍增管 测量光强度 发光底物 Dioxetane 分为竞争法与夹心法两类 BECKMAN公司Access分析原理

待测抗原 抗体包被磁粒 化学发光 标记抗原 + + + 化学发光免疫竞争法

非竞争性结合分析法（夹心法） 抗体包 被磁粒 待测 抗原 形成抗原- 抗体复合物 + 形成抗体-抗原- 标记体原复合物 化学发光标记抗体 +

电化学发光免疫分析（ECLIA） ECLIA是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应 激发物：三丙胺 发光标记物：三联吡啶钌的衍生物N-羟基琥珀酰胺酯标记抗体

ECLIA反应过程 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）和TPA, TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA

时间分辨荧光免疫分析（TrFIA） 镧系元素（如铕Eu）经激发后能发出特征性荧光，其荧光寿命较一般干扰荧光如血清 ， 溶剂等成分高数个数量级，可完全排除非特异本底荧光的干扰，故称时间分辨荧光 如：经0.5μs （340nm）脉冲光激发，延迟 400 μs ，用613nm检测并记录荧光强度 400μs ，间歇200 μs 再次激发，每一工作 周期仅1ms，每秒钟可重复检测1000次

Ab-Eu + 增强液 Ab-Eu + 增强液 时间分辨荧光分析检测原理 激发 Eu H2O 荧光 铕解离出形 成新螯合物 新螯合物在保 护微膜内形成 0.8 激发 发射 40 30 0.6 荧光密度 0.4 20 0.2 10 300 400 500 600 波长nm

TrFIA 增效处理（增强剂） 双功能鳌合剂 多标记

非放射性标记免疫与放 射性标记免疫分析的比较 试剂稳定，有效使用期长，可达6～12月 灵敏感度高，可达10-14－18g 标准曲线稳定，可达2～4周，节省试剂 自动化程度高，减少加样误差 出结果迅速，适合急诊检测 缺点：仪器及试剂成本较放免高，试剂与仪器不能兼容差，不利于市场竞争

体外分析的临床应用

甲状腺激素及有关激素：TT3、TT4、FT3、FT4、rT3、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH) 内分泌系统 甲状腺激素及有关激素：TT3、TT4、FT3、FT4、rT3、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH) 甲状腺自身抗体与抗原：TgAb,TmAb,TsAb与Tg抗原 甲状旁腺激素、降钙素、骨钙素等 胰岛素、胰高血糖素、C肽 肾上腺及有关激素：皮质醇、醛固酮、ACTH等

生殖激素：胎盘催乳素、绒毛膜促性腺激素等 性腺及生殖系统 垂体激素：LH、FSH、PRL 性腺激素：E2、E3、睾酮、孕酮 生殖激素：胎盘催乳素、绒毛膜促性腺激素等

心血管系统 心钠素、肌红蛋白、地高辛、肾素、血管紧张素、内皮素  神经系统 β内啡肽、生长激素、神经元特异烯醇酶(NSE) 血液系统 红细胞生成素、铁蛋白、血栓素、前列腺素

消化系统 CEA、AFP、乙型肝炎抗原及抗体、肝胆酸、胃泌素、胃动素等 泌尿系统 β2-MG、尿白蛋白、TH糖蛋白、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)

肿瘤疾病及其它 CEA、CA-50、CA-199、CA-125、CA-153、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、铁蛋白、肿瘤坏死因子、SOD等。

思考题 RIA的基本原理 RIA操作流程 RIA的质控指标 RIA与IRMA主要区别 受体的特点及与配基结合的基本特征