项目2：微生物发酵技术 任务2：工业培养基制备与灭菌 项目2：微生物发酵技术 任务2：工业培养基制备与灭菌

教学安排： 1. 员工培训 由老师讲解工业培养基理论基础。 分配实操任务：工业培养基的制备与灭菌。

2. 学生模拟组建运营一个培养基车间，撰写计划书(在理论教学期间完成)。 市场部：当前工业培养基的发展特点，培养基灭菌方法的技术进展。 技术部：确定工业培养基制备的技术路线，撰写操作规程。 品控部：制定工业培养基质量标准及检测方法。 总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。

3. 计划书实施。 计划书要先经过老师的审核，然后实施。 实施过程中考核操作技能。 实施后及时进行实训报告的撰写也总结。

第一节 概述 一 培养基组成 1 培养基配方组成：组成成分、各组成成分的浓度、合适的pH； 2 培养基随微生物的生理与产物不同而不同； 第一节 概述 一 培养基组成 1 培养基配方组成：组成成分、各组成成分的浓度、合适的pH； 2 培养基随微生物的生理与产物不同而不同； 3 培养基成分： (1)碳源：葡萄糖、淀粉； (2)氮源：碳酸铵、玉米浆；

(3)无机盐和微量元素； (4)前体和诱导物。 二 培养基组成影响细胞分化和产物形成 细胞分化：细胞形态、生理功能和化学组成上彼此不同； 培养基组成影响细胞分化： 二价阳离子、阴离子聚合物、表面活性剂、固形物含量、各成分的浓度、培养液的pH。

例： 在碱性培养基中产黄青霉易形成球状体； 二价阳离子诱发细胞呈球形； 无素锰可通过改变黑曲霉菌细胞壁的成分； 生物素和青霉素能改变细胞膜的成分。

三 配制工业发酵培养基的一般要求 (1)组成丰富，浓度适当； (2)各成分之间彼此不反应； (3)粘度适当，具有适当的渗透压； (4)成分要有利于主产物的合成，不利于副产物的合成； (5)即不影响通气与搅拌，又不影响或稍微影响产物的分离精制和废物处理； (6)因地制宜，质优价廉，成本低。

第二节 培养基的成分 一 碳源 碳源：构成微生物细胞和代谢产物； 能源。 (一)糖类 单糖、双糖、多糖、淀粉质类和糖蜜； (二)脂肪 第二节 培养基的成分　 一 碳源 碳源：构成微生物细胞和代谢产物； 能源。 (一)糖类 单糖、双糖、多糖、淀粉质类和糖蜜； (二)脂肪 利用油脂增加微生物需氧量，产酸，降pH；要注意贮藏油脂，防止产生过氧化物。

(三)有机酸和醇； (四)碳氢化合物； 二 氮源 构成细胞成分，亦可作碳源使用。 (一)无机氮源的特点 1 成分单一，质量较稳定； 2 易被菌体吸收利用； 3 改变培养液的pH。 生理酸性物质与生理碱性物质。

(二)有机氮源的特点 1 成分比较复杂； 2 被菌体利用的速度不同； 速效氮源：玉米浆； 迟效氮源：黄豆饼粉和花生饼粉。 3 微生物对氨基酸的利用有选择性； 部分氨基酸即可用于菌体生长，亦可用于次级代谢产物的合成。 4 是引起发酵水平波动的主要因素。 常用有机氮源：黄豆饼粉、棉籽饼粉、麸质粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等。

三 无机盐和微量元素 许多金属离子低浓度呈刺激作用，高浓度呈抑制作用。 1 磷 (1)组成生物大分子：核酸、核蛋白； (2)作为缓冲液调节pH； (3)对某些次级代谢产物有抑制作用。 常用磷酸盐：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其钠盐。

2 硫 构成细胞生物分子。 常用化合物：硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、硫代硫酸钠。 3 铁 是细胞色素C、细胞色素氧化酶和过氧化酶的组成元素，同时对许多产物合成有抑制作用。 常用化合物：硫酸铁。

4 锌、镁、钴 锌对部分抗生素合成有促进作用及操作菌体生长，过量则抑制。常用化合物：硫酸锌； 镁激活一些酶，能提高一些菌体对本身所产抗生素的耐受性。常用化合物：硫酸镁； 钴是维生素B12的元素之一。常用化合物：氯化钴。

5 钠、钾、钙 钠：细胞质细胞渗透压； 钾：影响细胞膜透性； 钙：调节细胞膜透性，控制pH。 四 水 功能： (1)溶剂与运输介质； (2)参与生化反应； (3)维持生物大分子稳定性；

(4)传递热； (5)维持细胞形态； (6)控制酶的活性。 水的活度。 五 前体 在产物的生物合成过程，被菌体用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。 内源性前体和外源性前体。

六 消泡剂 植物油、动物油和一些化学合成的高分子化合物。 七 其他成分 生长因子与诱导物。

第三节 培养基的种类与选择 一 培养基的种类 1 按培养基的组成分为合成培养基和复合培养基 合成培养基：由已知组成成分的各种营养物质组合的培养基； 复合培养基：由一些组成成分不完全明确的天然产物和一些无机盐组成的培养基。

2 按形态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基； 3 按用途可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。 (一)孢子培养基 一般要求： (1)基质浓度(特别是氮源)要低些； (2)无机盐的浓度适量。 常用孢子培养基： 麸皮、大(小)米、琼脂培养基。

(二)种子培养基 一般要求： (1)营养成分易被吸收，丰富与完整，其中维生素与氮源略高； (2)与发酵培养基有内在联系。 成分： 葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、尿素、硫酸镁、磷酸盐等。

(三)发酵培养基 组成完整丰富，浓度与粘度适中；原材料质量稳定，且不影响产品分离精制。 二 培养基的设计 满足元素与能量要求。 考虑因素： 1 细胞的元素组成状况(表3 -7)； 2 微生物对生长因子的需求； 3 营养成分与代谢产物的内在联系； 4 实验验证。

三 培养基的筛选 单因子法。

第四节 影响培养基质量的因素 一 原材料质量的影响 1 有机氮源影响最大(黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨)； 2 碳源的纯度； 3 油脂的质量； 4 无机盐和前体物的质量。

二 水质的影响 水中所含无机离子与有机物的含量。 三 灭菌的影响 灭菌对营养成分有破坏作用。 (1)葡萄糖的破坏：与氨基酸反应、与磷酸盐反应； (2)无机盐之间的反应； (3)泡沫影响灭菌效果。

四 pH的影响 pH值偏高或偏低会加速培养基成分的分解； 控制pH以生理酸性或生理碱性物质为主，以酸碱为辅； 培养基对pH有缓冲作用。 五 其他影响因素 粘度； 氧化还原电位； 投错料、计算错误等。

第五节 单糖制备

淀粉糖的制备

一、淀粉的组成及其特性 1 淀粉的组成

淀粉的组成 （1）直链淀粉 （2）支链淀粉 （3）聚合度

2 淀粉的特性 （1）糊化——淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊，这一过程称为糊化。 （2）淀粉与碘作用，产生鲜明的蓝色“淀粉—碘”复合物。

二 淀粉水解糖的制备方法

1 酸解法 ——是以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化葡萄糖的方法。

酸解法 优点： —— 设备要求简单，由淀粉逐步水解为葡萄糖的整个化学反应过程仅在一个高压容器进行； —— 水解时间短，在0.3Mpa左右压力下仅需5 ~ 20 min。

酸解法 缺点： （1） 要求耐腐蚀、耐高温、耐高压的设备； （2） 除了淀粉的水解反应外，尚有副反应，将造成淀粉转化率降低； （1）  要求耐腐蚀、耐高温、耐高压的设备； （2）  除了淀粉的水解反应外，尚有副反应，将造成淀粉转化率降低； （3）  葡萄糖液色素深，质量差； （4） 对淀粉原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大且要均匀； （5）  淀粉乳浓度不宜过高。

2 酶解法 ——酶解法是用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖。酶解法制葡萄糖可分为二步：第一步是利用α—淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为“液化”。第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为“糖化”。淀粉的“液化”和“糖化”都是在微生物酶的作用下进行，故也称为双酶水解法。

酶解法 优点： （1） 反应条件温和，不需耐高温、耐高压、耐腐蚀的设备； （2） 葡萄糖液颜色浅，质量好； （1） 反应条件温和，不需耐高温、耐高压、耐腐蚀的设备； （2） 葡萄糖液颜色浅，质量好； （3） 酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，淀粉的转化率高； （4） 对淀粉要求不高，可用粗原料； （5） 可在较高淀粉乳浓度下水解。

酶解法 缺点： （1）酶解反应时间较长； （2）要求的设备较多。

3 酸酶结合法 ——（1）酸酶法 ——（2）酶酸法

三 水解糖液的质量指标 1 色泽：浅黄、杏黄色，透明液 2 糊精：无 3 还原糖含量：24~32%（根据生产需求） 4 透光率：85%以上 三 水解糖液的质量指标 1 色泽：浅黄、杏黄色，透明液 2 糊精：无 3 还原糖含量：24~32%（根据生产需求） 4 透光率：85%以上 5 DE值： 96%以上

四 淀粉酸水解机理

淀粉酸水解机理 （1）淀粉水解过程的变化 淀粉 →糊精 →低聚糖 →葡萄糖 碘显色： 蓝色→暗紫→紫→红褐→暗红→红→浅红 糊精不溶于乙醇

淀粉酸水解机理 （2）葡萄糖对淀粉的理论转化率 （C6H10O5）n + n H2O = n（C6H12O6） 162.14 18.02 180.16 淀粉产生葡萄糖的理论转化率为：

淀粉酸水解机理 （3）DE值 ——DE值即葡萄糖值，用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是葡萄糖占干物质的百分率，即：

淀粉酸水解机理 2 葡萄糖的复合反应 ——复合反应是有害的，它降低葡萄糖的收率，影响葡萄糖的结晶。 ——淀粉乳浓度高，水解所得的葡萄糖浓度也高，致使复合反应进行强烈。

淀粉酸水解机理 3 葡萄糖的分解反应 5’—羟甲基糠醛和有色物质的生成量随葡萄糖的浓度增加而增加，随反应时间的延长而增加。

五 淀粉制糖工艺 1 双酶法 （1）工艺流程 淀粉 →调浆 →调PH值→加淀粉酶→喷射液化 →液化维持 → 灭液化酶 → 降温 →调PH值 五 淀粉制糖工艺 1 双酶法 （1）工艺流程 淀粉 →调浆 →调PH值→加淀粉酶→喷射液化 →液化维持 → 灭液化酶 → 降温 →调PH值 →加糖化酶 →糖化→灭糖化酶→降温→调PH值 →降温→加活性炭、助滤剂→脱色→压滤 →葡萄糖液

（2）工艺参数 A） 调浆：10~18Be， B） 液化： 淀粉酶量—— 5~10单位/克干淀粉， 液化PH值——PH6.0~6.4， 液化温度—— 90~110℃， 液化维持时间—— 45~90min， C）  灭液化酶：灭酶温度—— 115~120℃， 灭酶维持时间—— 5~10 min

工艺参数 D）糖化： 糖化酶量——80~100单位/克干淀粉， 糖化PH值——PH4.4~4.6， 糖化温度—— 55~60℃， E）灭糖化酶： 灭酶温度—— 85℃左右， 灭酶维持时间—— 5~10 min

工艺参数 F）  脱色： 脱色PH值——PH 4.8， 脱色温度——45~60℃， 脱色时间——4~8h。

（3）糖化过程中DE值的变化

（4）节能设施在双酶法中的应用

（5）双酶法的设备 调浆罐、液化喷射器、 液化维持罐、换热器、 糖化罐、脱色罐、 压滤机、贮糖罐、 物料泵、冷却塔、水泵

2 酸法 （1）工艺流程 淀粉 →调浆 →加酸 →升温 →维持 →冷却 →中和 →脱色 →压滤 →葡萄糖液

（2） 工艺参数 A） 调浆：10~12 Be B） 水解：PH1.5 压力0.28Mpa 温度135~140℃ 时间15~20min C) 中和： PH4.8 D) 脱色： 时间 4~8

糖蜜原料处理 一、糖蜜原料的分类 生物发酵工业所用的糖蜜，主要是指制糖工业上的废糖蜜(waste molasses)，它是甘蔗糖厂或甜菜糖厂的一种副产品。糖蜜是一非结晶糖分，本身含有相当数量的发酵性糖 根据来源不同，糖蜜分为甘蔗糖蜜(cane molasses)、甜菜糖蜜(beet molasses)和高级糖蜜(high test molasses)等

二、糖蜜原料的性质和组成 糖蜜的外观是一种黏稠、黑褐色、呈半流动状的物体，pH值5.5左右，相对密度1.43。 各种糖蜜中的糖类的组成也不相同。除含有发酵性的糖分外，还含有胶体物质(为植物细胞壁上的多糖，要求少于0.008%，影响酵母生长和色泽 )、灰分(Ca2+、Mg2+等)、

挥发性有机酸(甲酸、醋酸、丁酸、丙酸等，不能超过0.3% )、有机酸(具有危害的是亚硫酸，不能超过０.１２５%二氧化硫 )、微生物。 甘蔗糖蜜中的生物素较甜菜糖蜜中高。

三 糖蜜处理的目的与原理 目的： 1 蔗糖水解 蔗糖是由一分子果糖与一分子葡萄糖构成的双糖，水解后为果糖和葡萄糖。 2 除杂质 1 蔗糖水解 蔗糖是由一分子果糖与一分子葡萄糖构成的双糖，水解后为果糖和葡萄糖。 2 除杂质 主要是胶体、灰份等。

原理： 加酸 双糖转化成单糖 ； 硫酸、磷酸和石灰乳作用产生硫酸钙沉淀 ； 释出挥发酸，可在沸腾和通风时驱除掉； 胶体絮凝。

加热 蛋白变性沉淀，促进胶体絮凝； 杀灭微生物。 通气 有害气体氧化驱除，如一氧化氮、二氧化硫、硫化氢等 ； 驱除挥发酸。

糖蜜中发酵糖的转化率=------------------------------------ 糖蜜处理的质量要求： 钙的含量 < 0.02% 胶体含量 < 0.1% 发酵糖转化率≥85% 发酵糖转化率计算公式为： 处理后还原糖总量—处理前还原糖总量 糖蜜中发酵糖的转化率=------------------------------------ 处理前总糖量—处理前还原糖总量

测定方法： 还原糖 滴定； 胶体 酒精沉淀干燥法； 灰份 灼烧

六 糖蜜处理 1 处理量计算 根据培养基的消耗计算糖的需求量，再根据糖蜜中糖的含量折算，并做适度放大。

2．一次处理法 （1）糖蜜加水稀释至15—17 oBx。 （2）加0.5%（按糖蜜重量计）工业用浓硫酸和0.5%磷酸（磷酸按45%计）（调pH在2.0至3.0之间）。 （3）加热煮沸 （4）通风0.5—1小时，使温度降到90℃左右。 （5）加石灰乳使pH至4.8—5.1，澄清16—24小时（若沉淀不完全，可用离心去除）。

3、二次处理法（适于含杂质较多的糖蜜） （1）糖蜜加水稀释至15—17 oBx。 （2）加0.5%（按糖蜜重量计）工业用浓硫酸和0。5%磷酸（磷酸按45%计），澄清16—24小时。清液加热通风后，加石灰乳使pH至4.8--5.1，再澄清16—24小时备用。

第六节 培养基和发酵设备的灭菌 一 培养基灭菌温度的选择 二 培养基的灭菌方法 （一）分批灭菌 （二）连续灭菌。 第六节 培养基和发酵设备的灭菌 一 培养基灭菌温度的选择 二 培养基的灭菌方法 （一）分批灭菌 （二）连续灭菌。 1 由热交换器组成的连续灭菌系统； 2 蒸汽直接加热培养基的连续灭菌系统； 3 由连消塔、维持罐和冷却器组成的连消系统。

作 业 1、配制工业发酵培养基一般有哪些要求？ 2、培养基中含有哪些成分？常用碳源与氮源有哪些？无机氮源与有机氮源各有何特点？ 作 业 1、配制工业发酵培养基一般有哪些要求？ 2、培养基中含有哪些成分？常用碳源与氮源有哪些？无机氮源与有机氮源各有何特点？ 3、影响培养基的质量因素有哪些？如何防止这些因素对培养基质量的负面影响？

4、画出一条培养基连续灭菌的工艺流程图，并简要说明。 5. 介绍淀粉糖的制备工艺。 6. 介绍酸法糖蜜处理工艺。 7. 培养基灭菌方法有哪些？各方法需要哪些设备投入？