花药与花粉培养 主讲人：王玉龙

一、花药与花粉培养的概念 1、花药培养 通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，进行诱导、分化，最终形成完整植株的技术。

2、花粉培养 将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也叫小孢子培养。

1、单倍体：指具有配子体染色体数的孢子体。（植物个体） 二、单倍体 1、单倍体：指具有配子体染色体数的孢子体。（植物个体） 草莓花药愈伤组织

2、单倍体植物的特点 与其二倍体相比较，有三个明显的特点： A、体细胞染色体数减半 B、生长发育弱，体形小，器官明显减小 C、雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代

3、单倍体应用潜力 A、迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 B、获得育种中间材料 C、与诱变育种相结合可以提高诱变频率 D、与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 E、作为遗传工程受体更为有效

三、花粉和花药培养的基本程序 外植体 花蕾预处理 外植体消毒 剥取花药 接种 诱导培养 分化培养

草莓花药再生植株

四、培养材料的选取与制备 （一）材料的选取 考虑因素： ◆基因型 ◆小孢子发育时期 ◆生理状态

花 的 结 构 雄芯 花药 花丝 柱头 雌芯 花柱 子房 花瓣 花冠 花萼 花托 花柄

1、基因型 供体植株遗传背景 选择易培养成功的材料 以花药培养获得单倍体植株的植物： 茄科 十字花科 禾本科 百合科

品种 接种花药数 产生胚状体数 诱导率（%） 元帅 赤阳 国光 金冠 978 1410 1073 1302 21 10 7 2.1 0.7 不同苹果品种的花药培养胚状体的诱导率 品种 接种花药数 产生胚状体数 诱导率（%） 元帅 赤阳 国光 金冠 978 1410 1073 1302 21 10 7 2.1 0.7 0.6 0.5

大多数植物，在单核时期的花粉比较容易培养成功。 2、花粉发育时期的选择 　　大多数植物，在单核时期的花粉比较容易培养成功。 确定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。 电镜下的花粉粒

A、花粉发育时期 四分体 小孢子 单核花粉 双核花粉 最适期

B、花药和花粉培养的取材时期 四分体 单核早期 单核晚期 双核早期 双核晚期 三核期 小孢子 花粉粒 花粉培养 花药培养

Sunderland（1971）对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察： 花粉发育时期 胚状体诱导率（%） 减数分裂期 0 单核时期 14 单核晚期 44 双核时期 55

烟草小孢子发育时期对胚状体诱导率的影响 小孢子发育时期 培养花药数 胚状体（%） 单核早期 单核靠边（中） 单核靠边（晚） 双核早 双核晚 15 77 21 63 30 7.8 19.4 1.59

一些植物花药和花粉培养适宜的小孢子发育时期 适宜小孢子发育时期 代表植物 减数分裂期 四分孢子期 单核早期 单核晚期 单核早期至晚期 单核早期至双核期 四分孢子期至双核期 番茄、草莓 葡萄 油菜、苹果、石刁柏 小麦、茄子、青椒、荔枝、楸子 烟草、柑橘、橡胶、龙眼、杨树 水稻、甘蓝、梨 玉米

不同季节接种的花药愈伤组织诱导率有显著变化。 3、生理状态的选择 　不同季节接种的花药愈伤组织诱导率有显著变化。 百合的成熟花粉

（二）预处理 花药和花粉的预处理措施主要是低温处理 ◆耐寒植物比喜温植物处理的温度可低些 ◆较低温度处理时间要短，较高温度处理时间宜长

低温处理的作用机理： A、低温可改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，使得花粉朝着胚胎方向发育； B、低温使花粉保持较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。

低温（3℃ ）处理对四季橘花药愈伤组织和胚状体形成的影响 天数 接种 花药（枚） 发生愈伤组织的 花药 发生胚状体的花数 枚 % 对照 5 10 15 20 25 848 723 902 846 470 434 8 9 18 3 0.59 1.11 1.00 2.13 1.06 0.69 12 2 0.94 1.66 0.43

（三）外植体制备及接种 材料：未开放的花蕾 原因：花药和花粉处于无菌状态 灭菌：表面灭菌杀灭花蕾表面微生物 处理强度以轻为好

1、花药和花粉培养的表面灭菌 ◆ 70%—75%酒精浸润花蕾30s左右; ◆饱和漂白粉溶液中浸泡10—20min，或在0.1%升汞溶液中处理10min左右; ◆无菌水漂洗3—5次.

2、获得花粉的方法 A、机械挤压梯度离心法 ◆花药消毒 ◆用镊子或小玻璃杵子将花粉从花药中挤压出 ◆用30%蔗糖离心收集悬浮上层的完整花粉粒 ◆用培养基洗涤几次 ◆培养

B、自然散粉法 ◆消毒后的花药接种在液体培养基中 ◆一定温度下振荡培养 ◆花粉自行散落到培养基中 ◆除去花药壁 ◆花粉重新培养在新鲜培养基上

机械方法分离处理后的花药和花粉粒，需经过分离、过筛和清洗三个步骤。 后用液体培养基培养，并保证培养基成分的稳定性。

（四）培养方法及培养基的选择 培养方法： 液体培养 双层培养 分步培养 看护培养 微室培养 最常用的培养基是MS培养基。

五、影响因素 光照 温度 湿度 pH 培养基成分 蔗糖浓度 激素

六、单倍体植株的鉴定和染色体加倍 花药和花粉培养的主要目的是制备单倍体植株，但其再生植株并不都是单倍体。因此，必须对获得的花药和花粉植株进行倍性鉴定。

鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法有： ◆形态鉴定 ◆结实性鉴定 ◆染色体数目鉴定 ◆遗传标记鉴定

单倍体植株只有配子染色体组成，生活力弱，难以长期存活。因此，对鉴定的单倍体植株应进行染色体加倍处理。 常用方法： 利用0.02%—0.4%秋水仙素处理花药和花粉单倍体植株。