抗微生物肽研究进展 Antimicrobial peptides 王贵强 北京大学第一医院

Leading causes of death(WHO 1998) Heart disease Cerebrovascular disease Acute lower respiratory disease HIV/AIDS Chronic obstructive pulmonary disease Diarrheal disease Perinatal Conditions Tuberculosis

Leading causes of mortality-WHO 2000

Leading causes of mortality-WHO 2000

病原微生物与疾病 各种感染性疾病（包括传染病） 肿瘤 溃疡病 自身免疫性疾病 代谢性疾病？ 抗病原微生物治疗的重要性

抗生素时代（1941年～2000年） 1941年：青霉素 1944年：氨基糖甙类抗生素 1947年：氯霉素 1950年：青霉素对金葡菌100％有效 1985年：青霉素对金葡菌仅5％有效 1992年：40％金葡菌耐甲氧西林青霉素，仅对万古霉素敏感 1997年：对万古霉素耐药的金葡菌报告

抗生素耐药的发生 自然选择机制 非人类抗生素使用（50%） 抗生素滥用或使用不规范 药品质量不合格或假药 动物、农业、水产业和植物 过分应用，针对性差 剂量、疗程不足（医生和病人因素） 药品质量不合格或假药

目前细菌耐药所带来的问题 细菌感染并发症增加，病死率增加 病程延长 慢性化趋势 传染病的传播 院内感染发生，增加原发病死亡 医疗费用大幅度增加

后抗生素时代 post-antibiotics era The era of the ″classical antibiotic″ may be over 短的繁殖周期和细菌遗传可塑性使细菌的耐药能力快速发生 细菌耐药性变异使目前的抗生素治疗无效

近30年内，针对病原菌的抗生素的开发没有突破性的进展 开发新的抗微生物药物的迫切性 新药开发的速度有限 近30年内，针对病原菌的抗生素的开发没有突破性的进展

人类、动物和植物等生命体何以能够抵抗病原微生物的攻击？

抗微生物肽 Antimicrobial peptides(AMPs) 古老而广泛存在的一种天然防御机制 在细菌、原生动物、植物、以及动物从昆虫到鱼类、两栖动物和哺乳动物等 1975年瑞典学者Boman等首先在天蚕蛹体内诱导出具有抗菌活性的小分子多肽-天蚕素 (Cecropins) 陆续发现如蛙皮素（Magainins)、蜂毒素（Protegrins) 和防御素 ( Defensins) 等 近20年，已经发现了约 800 种AMPs

抗微生物肽 PubMed search: Antimicrobial Peptides 截止到2003年10月6日共3699篇 800 600 400 200 1993 1998 2003 Publications per year ratio

AMPs特性 15~45个氨基酸，一般不超过60 分子量为４～６kD 表面为阳离子电荷 疏水性或两性分子 对热稳定，100C 10~15分钟 作用于细菌细胞壁 有明确的基因编码和调控

AMPs分类-根据化学结构 线性的螺旋结构，无半胱氨酸 线性的螺旋结构，无半胱氨酸，但富含某种氨基酸残基如脯氨酸和／精氨酸等 有一个二硫键，其位置常在C 末端 β片层结构，分子内有2～3 个二硫键，具有β折叠结构 多肽衍生而来 PRO 3’-UTR 5’-UTR PRE Mature Peptide

AMPs分类-根据来源 哺乳动物：嗜中性粒细胞、粘膜和皮肤等 两栖动物：蛙类（Magainins, Dermaseptins） 防御素（Defensin）：和 两栖动物：蛙类（Magainins, Dermaseptins） 昆虫：天蚕素（Cecropin） 植物：抗真菌 细菌： 病毒：HIV p21 人工合成：利用计算机辅助设计

dermaseptin Pyllomeduza bicolor Family name: DERMASEPTIN A1L2W3K4T5L6L7K8K9V10L11K12A13 Family name: DERMASEPTIN Properties: Linear peptides of 28-34 aa (natives) Structure: Amphipathic alpha-helix Pyllomeduza bicolor dermaseptin

电镜下细菌破坏图 after 1 min exposure to dermaseptin Leishmania major

SMAP-29 37°C 30min Fig. 2. Scanning electron micrographs of untreated (A and C) and after treatment for 30 min at 37³C with 2 WM (B) and 5 WM (D) SMAP-29 of E. coli (top) and S. aureus (bottom). FEBS Letters 463 (1999) 58^62

AMPs作用机制 作用于微生物细胞膜/壁

抗生素作用机制 作用于细菌细胞壁 作用于核糖体 作用于质膜完整性 作用于核酸 作用于叶酸

细胞壁合成 RNA延伸 DNA螺旋酶 抗生素作用机制模式图 RNA多聚酶 叶酸代谢 50S抑制剂 30S抑制剂 影响细胞质膜结构 蛋白质合成

抗微生物肽对生物膜作用的特异性 Nature (2001) 412, 389-495

AMP杀菌机理图 Biopolymers 47, 451-463 (1998) Biopolymers 47, 451-463 (1998)

抗微生物肽机制模式图 FIGURE 1 Schematic representation of the proposed models for the mode of action of a-helical AMPs. (A) Electrostatic attraction to anionic microbial surface, (B) passage across the outer membrane and/or peptidoglican layer, (C) electrostatic attraction to anionic phospholipids in the cytoplasmic membrane, (D) structuring, membrane insertion and accumulation, (E) toroidal pore formation, (F) carpet mechanism for membrane permeabilization, (G) barrel stave pores formation, and (H) secondary effects (DNA/protein binding, membrane compositional rearrangements, interference with essential cellular machinery, etc.).

临床应用 已经有许多临床应用的资料 以局部应用为主 抗肿瘤 抗病毒

X-DD (20 µM) 10 aa, a-helix Pre-clinical Comparing bactericidal kinetics (S. aureus) and Lysis of human erythrocytes

Increased Stability of Dermaseptin Derivatives (DD) in Plasma. Peptides were pre-incubated in human plasma (50%, 37˚C) then added to bacterial cultures (S. aureus, 37˚C, overnight). t1/2 (DD) ~0.5 Hr; t1/2 (X-DD) ~3 Hrs DD (MICs) X-DD (MICs) Increased Stability of Dermaseptin Derivatives (DD) in Plasma.

Survival Control 4/16 Treated (5 mg/Kg) 13/16

Multiple exposure of P. aeruginosa to classical antibiotics results in emergence of resistant strains

抗菌应用-局部治疗 细菌素- III期临床 马盖宁MSI78- III期临床 IB2367- III期临床 胃溃疡 食物防腐剂广泛应用 治疗糖尿病合并的足部溃疡：926例 IB2367- III期临床 肿瘤病人口腔溃疡

抗菌应用-系统治疗 人工合成肽CA P218 Protegrin Indolicidin BPI-III期临床 绿脓杆菌引起的腹部感染 耐药性金葡菌、肠球菌和绿脓杆菌等 Indolicidin 曲霉菌 BPI-III期临床 杀菌、抗内毒素，降低儿童流脑的病死率

对抗细菌感染导致的毒素效应 半乳糖胺敏感的小鼠发生内毒素休克 BPI对抗内毒素

抗甲氧西林耐药金葡作用

抗真菌作用 万古霉素 抗菌肽 多粘菌素B

AMPs的应用前景 治疗各种病原微生物感染 抗内毒素 食物等防腐剂 医疗耗材的内衬（如各种导管） 影像学介入治疗器械 抗肿瘤 免疫调节作用 农业应用

在动植物转基因工程中的应用 Jaynes等将Shiva-1基因转入烟草和马铃薯 应用腺病毒载体，将人LL-37基因导入鼠体内，鼠对内毒素和大肠杆菌抵抗力显著提高。 Durvasula将天蚕素A导入长红猎蝽后，发现此昆虫体内锥虫数量明显减少或消失。

Bactericidal kinetics of E. coli 0157 in apple juice 食品应用 Temperature: Salt: pH:

Graft removed after 7 days +/- DD or antibiotic Graft removed after 7 days +/- antibiotic Bacteria (2x107) CFU counts Dacron Rat graft model:

Induction of graft-associated infection Dacron tubes soaked in a solution (10 mg/L), implanted (s.c.) and inoculated (107 CFU) to 15 rats/group. => Rifampin was injected i.p. to some grafted rats. Induction of graft-associated infection Star indicates zero CFUs

抗肿瘤、抗病毒应用 马盖宁公司：对病毒（HSV-1) 和肿瘤都具杀伤效应的小肽-MAI-78。已进入III期临床 Wachinger发现天蚕素和蜂毒素在亚致死浓度下可以抑制 HIV-1基因的表达

需要进一步研究的问题－１ 特异性 生物利用度 给药途径 半衰期 组织浓度 代谢途径 耐药性

需要进一步研究的的问题－２ 制备技术：生产成本 表达系统载体：基因工程 稳定性 免疫原性

结论 特异性 对抗生素耐药的细菌有效 抗微生物谱广泛 应用领域广泛 不易产生耐药性 能抑制细菌产物对机体的伤害

Thank you! 谢谢