Trends In Development of Cytopathology 细胞病理学发展趋势 Trends In Development of Cytopathology 山东省肿瘤医院 宋现让

细胞学发展简史 现代细胞学阶段 细针抽吸细胞学阶段 脱落细胞学阶段 萌芽阶段 1980’s-present 1930-1980’s Before 1928 萌芽阶段

萌芽阶段 1838年Donne首先在显微镜下从人类初乳的新鲜涂片中发现了脱落细胞 Mueller提出了利用显微镜从人的体液、分泌物中寻找癌细胞 1845年Donne率先开展了对肺癌病人痰液的细胞学检查 1853年Donaldson从病人的体液中发现了恶性细胞，开创了浆膜腔积液脱落细胞学诊断的先例 然后依次是咽喉癌患者的痰液，胃癌病人的胃液等 1928年Paranicolaou对阴道涂片标本进行着色固定成功（巴氏涂片）是脱落细胞学的标志

脱落细胞学阶段 1941年Paranicolaou和Traut报告阴道脱落细胞学检查对宫颈癌的诊断正确率达84.3% 巴氏将这种方法推广到其他恶性肿瘤的诊断，广泛地应用于空腔脏器恶性肿瘤，诊断宫颈癌、肺癌、食道癌、鼻咽癌、膀胱癌、胃癌等 涂片取材方法的改进，如体液、分泌物的浓集，食管拉网、宫颈刮片等

针刺抽吸细胞学阶段 上述取材方法，仍仅限于空腔脏器肿瘤的检查，而实质性脏器则无法查到它的脱落细胞 穿刺活检——实质性脏器取材方法，始于19世纪 粗针穿刺：出血、感染、气胸、肿瘤播散 1930年Martin和Ellis创立了细针抽吸细胞学(Fine-needle aspiration cytology,FNAC)用于肺癌诊断，在临床医师的推动下，很快积累了大量病例，诊断效果显著 FNAC技术广泛应用于肝、肺、肾、胰、乳腺、甲状腺、淋巴结

现代细胞学阶段 现代细胞学阶段的标志： 取材手段多样化，制片技术规范化 形态学、免疫学、细胞分子生物学联合 1 取材手段多样化，制片技术规范化 形态学、免疫学、细胞分子生物学联合 2 不只用于诊断，还用于分期、预测、预后 3 4 形态自动识别、全程质量控制等 5 细胞病理学与临床的紧密结合

丰富的取材手段 内窥镜、X线和B超等检查手段与针吸技术有机结合 头颈部肿块：淋巴结、鼻咽部、甲状腺、唾液腺的细针穿刺 胸部肿块：CT引导的经皮肺穿刺针吸（Transthoracic needle aspiration, TTNA）、内镜下经支气管针吸（Transbronchial needle aspiration， TBNA）、支气管内超声引导针吸（Endobronchial ultrasound-needle aspiration，EBUS-NA）、 食道超声引导针吸（Esophage ultrasound-needle aspiration，EUS-NA） 肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、盆腔肿块：B超或CT引导经皮穿刺针吸 前列腺：经直肠超声引导前列腺穿刺

肺的微创细胞学诊断 TTNA：肺周围型病灶 气管镜毛刷（Bronchial brushing，BB）：支气管镜下或荧光支气管镜下能看到的粘膜改变 TBNA：纵隔和肺门占位性病变及肿大淋巴结的诊断、周围型肺癌，鉴别良性肺部疾病 EUS-NA：纵隔、肺门、食管附近诊断的占位性病变和肿大淋巴结

新技术的应用 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM) 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH) 免疫化学染色 DNA倍体 基因突变 肿瘤相关病毒

流式细胞术

流式细胞术

FCM染色 细胞内外成分直接染色，如DNA的PI染色 荧光染料标记物与细胞内外成分结合 抗体 Annexin Ⅴ dUTP

Common Laser Lines PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid Texas Red PE-TR Conj. PI FITC 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 Common Laser Lines

FCM在临床细胞学的应用 白血病和淋巴瘤的免疫分型 DNA倍体分析用于肿瘤诊断 凋亡检测用于放化疗敏感性评价 血液和淋巴结微转移肿瘤细胞的检测和分选 淋巴细胞亚群分析

FCM白血病免疫分型 白细胞分化抗原 （cluster of differentiation /cluster designation， CD抗原）: 是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中，在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的生理和病理过程。八十年代在WHO和国际免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群。

FCM白血病免疫分型

FCM免疫分型的意义 鉴别淋髓系列 区分亚型 双表型、杂合型  Mo、M7、AUL 提示细胞遗传学异常  部分与预后相关  MDR监测

细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 细胞增殖周期测定的理论基础：在细胞周期的不同时相细胞内DNA含量不同DNA倍体分析 G1 M G2 S G0

DNA倍体与肿瘤诊断 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标

凋亡检测 细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining Caspases 检测

Annexin V Assay 能够区分死亡与凋亡 凋亡检测 Annexin V Assay 能够区分死亡与凋亡

凋亡检测

FCM检测微转移细胞 白血病微小残留病灶的检测 血液循环中上皮来源恶性肿瘤细胞的检出 选用抗体：CD45、CK或EpCAM、肿瘤细胞特异性抗原（如PSA、2F7/S5A、proGRP）

Fluorescence In Situ Hybridization

FISH 探针 分裂期细胞染色体FISH 间期细胞染色体FISH 单拷贝探针 简单重复序列探针(simple repetitive probes) 或异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes) 染色体涂染探针(chromosome painting probes)或整条染色体探针 分裂期细胞染色体FISH 间期细胞染色体FISH

FISH在细胞学领域的应用 白血病的诊断：白血病特异的染色体易位 估计预后、监测治疗和检测微小残留病：某种类型白血病特异的染色体或基因改变与预后、疗效有关 （济南市中心医院中心实验室 丁卜同） 靶向治疗的选择：靶向治疗分子编码基因扩增的检测，如HER-2，EGFR

EGFR 基因FISH结果 乳腺癌 （山东省肿瘤医院基础研究中心）

基因突变与细胞学诊断 P53 突变和ras突变检测结合细胞形态学诊断肺癌的研究 大便ras突变检测诊断大肠癌

P53 5~8外显子突变位及检测引物

痰P53突变检测

痰细胞学和P53、ras突变检测诊断肺癌 51例肺癌和32例肺部良性疾病患者 分组 痰细胞学 P53突变 Ras突变 DNA倍体异常 肺癌 19（37.3%） 27（45.1%） 10（19.6%） 15（29.4%） 非肺癌 1（3%） 2（6%）

原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（Is-PCR）是 由Haase等 于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段, 在不破坏细胞的前提下, 利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测含量较少的靶序列。 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高, 但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来, 成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表 达产物等方面发挥一定作用。

存在的问题： ①特异性不高，特别是假阳性的问题。产生的原因有引物与模板的错配、在扩增中因细胞内受损伤DNA的修复而形成的非特异性序列和特异性扩增序列的弥散等。 ②技术操作复杂，影响因素太多。 ③需要特殊的设备，即原位PCR仪，价格昂贵。

HPV检测与宫颈癌诊断 世界范围内宫颈癌组织中 HPV亚型的分布图 33,35,39,51,52,56,58,59,68 依据HPV与肿瘤的关系，感染生殖器的HPV可分为为低度危险型(HPV6, 11, 40, 42, 43, 44, 和54型)和高度危险型(HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 和58型) 世界范围内宫颈癌组织中 HPV亚型的分布图

HPV 感染与宫颈病理病变的关系

HPV检测技术 杂交捕获法（hybrid capture Ⅱ,HCⅡ）是目前唯一获得美国FDA认证的HPV DNA检测方法，但该法采用通用探针，不能确定型别 Realtime PCR也可但检测通量低，每一反应管（孔）只能检测一种类型的HPV。 基因芯片可以一次快速、准确地对二十几种最常见的HPV进行检测 原位PCR，或原位杂交

超薄液基细胞学检查 薄层液基细胞学（Liquid-Based monolayers）——制片技术的改善 （1）收集更多的细胞、全部放入保存液 （2）避免损失、避免干燥变形 （3）程序化处理，去除血液、粘液等 （4）精密滤过、均匀薄片、清晰易读

A CONVENTIONAL PAP SMEAR AND A THINPREP PAP TEST THIN-LAYER

细胞病理学的应用与优势 进行人群或癌症高发区的普查：美国每年大约3500万ThinPrep Pap Tests，发现13000新宫颈癌患者，北京等10个省市地区612407例宫颈癌普查，发现早期浸润癌和原位癌占癌检出的61.02%。 早期诊断肿瘤：细胞学检查通过宫颈刮片、宫内膜吸片、食管拉网、尿、浆膜腔积液、溢乳涂片、痰涂片、内镜刷片、针吸内脏和体表肿块等途径方便快捷获得检测标本诊断癌细胞或肉瘤细胞并能够进一步明确组织类型。 认识癌前病变：为癌症防治提供形态学依据。 提示良性病变：诊断感染、增生等

细胞病理学诊断的局限性 取材不满意则降低诊断的敏感性 有时诊断困难：肿不典型增生细胞、组织修复细胞和某些良性改变细胞的影响，致使造成假阳性诊断，瘤细胞退变、发生变性和坏死等 鉴别组织类型非常困难

细胞病理学发展趋势 取材技术：多种技术手段联合，几乎没有取不到细胞的器官 应用辅助诊断的各种新技术：电子显微镜、免疫细胞化学，FCM，细胞自动识别和分子生物学等 临床重视程度提高：成为首选确诊技术。2007年美国胸科医师学会（ACCP）更新了《肺癌诊断和治疗指南》，对细胞学诊断手段在肺癌诊断中的应用做了详细的规定 自身建设：质量与规范，诊断医师的提高

To be an cytopathologist 学科交叉与融合 临床知识 细胞分子生物学知识 检验知识

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