国内外奶牛胚胎移植技术研究及产业化进展 北京安伯胚胎生物技术中心 余文莉

第一部分 奶牛胚胎移植及相关技术的 研究进展

奶牛胚胎移植技术 定义 是指对生产性能优良和遗传性稳定的母牛经过超数排卵处理后，将多出自然排卵数几倍的受精卵取出，或者将通过体外受精方式获得的胚胎，分别移植到生理状态相同的受体母牛体内，使之产出优良后代的技术。

奶牛胚胎移植技术的意义 1 充分发挥优良母畜的繁殖潜力，成倍提高繁殖效率 2 用MOET技术培育种公牛，加大选择强度，缩短世代间隔 3 代替活畜进行洲际、国际引种 4 建立基因库，保存品种资源

奶牛胚胎移植技术的关键技术环节 超数排卵技术 非手术胚胎采集技术 胚胎冷冻/解冻技术 受体牛同期发情技术 非手术胚胎移植技术

以胚胎移植为基础的相关胚胎生物技术 胚胎移植 A D B C E 其它 体外受精技术 胚胎性别 鉴定技术 胚胎分割技术 控制技术

国内外胚胎移植及主要相关生物技术的研究成果时间表 技术名称 国内 国际 时间差 牛超数排卵 1978 中科院遗传所和上海市奶牛公司 1940 Casida 38年 牛非手术冲胚 1978中科院遗传所和上海市奶牛公司 1972 Sugie 6年 胚胎程序化冷冻 1982中科院遗传所和上海市奶牛公司 1972 Whittingham 10年 胚胎玻璃化冷冻 1993 朱士恩 1985 Rall 8年 胚胎分割 1987 窦忠英 1981 Willadsen 胚胎嵌合体 1989 丛笑倩 1984 Bradley 5年 牛体外受精 1989 旭日干 1978 Brackett 11年 PCR胚胎性别鉴定 1992 曾溢滔等 1990 Herr 2年 牛活体采卵 1999 刘云海 1982 Sirard 17年 体细胞克隆 2000 张涌 1997 Wilmut 3年

牛胚胎移植主要专项技术国内外水平比较 技术名称 美国、加拿大 国内 超数排卵获可用胚* 5.5~6.5枚 5~6枚 鲜常规胚胎移植妊娠率 * 55%~65% 50%~60% 冷冻常规胚胎移植妊娠率* 40%~50% PCR性别鉴定准确率 98%±2% 性控胚胎雌性率 85%~95% 取样后鲜胚移植妊娠率* 50%~55% 取样后冻胚移植妊娠率* 性控胚胎妊娠率* *饲养管理水平对技术指标影响较大

奶牛胚胎移植及相关技术 研究进展

1. 超数排卵技术 牛超数排卵的目的：最大限度地获得受精卵和可用胚胎 牛的超排反应和胚胎质量变异性很大 1. 超数排卵技术 牛超数排卵的目的：最大限度地获得受精卵和可用胚胎 牛的超排反应和胚胎质量变异性很大 促性腺激素种类、批号、处理时间、剂量、年龄、季节、品种 处理时卵巢生理状态、营养状况、繁殖状态和重复超排次数等 牛的超排方法：CIDR+FSH+PG(16天) 目前的研究重点：提高超排效率 1、重复超排：间隔；超排次数 2、抑制素免疫提高牛超排效率 3、与超排有关的基因位点的研究

重复超排效果的比较 (数据来自北京安伯胚胎生物技术中心) 重复超排效果的比较 (数据来自北京安伯胚胎生物技术中心) 次别 处理牛数 超排有效 n % 平均 回收胚数 可用胚数 退化胚数 未受精数 第一次 84 78 92.9% 10.76±4.51a 7.26±3.65a 2.38±2.47a 1.12±1.51a 第二次 32 29 90.6% 10.59±5.94a 7.79±5.04a 2.00±1.73a 0.79±0.94A 第三次 28 96.6% 10.36±4.86a 6.25±4.06a 2.57±2.65a 1.54±2.53ABab 第四次 20 19 95.0% 12.26±6.66a 7.26±4.27a 2.53±3.67a 2.47±3.76Bb 第五次 13 12 92.3% 11.42±7.57a 7.08±5.71a 2.25±2.01a 2.08±2.15ABab 注：同列上标大写字母相同者表示差异不显著（P>0.05）

2. 同期发情技术 不同牛同期发情方案的效果比较*（李树静等，2002年） 方法 1次或2次PG肌注 CIDR+PG CIDR+E2+PG 2. 同期发情技术 不同牛同期发情方案的效果比较*（李树静等，2002年） 方法 1次或2次PG肌注 CIDR+PG CIDR+E2+PG 备注 原理 溶黄体 延长黄体期 外周血液孕酮水平迅速下降 发情率 53.1%（1次PG）； 81.0%（2次PG） 83.2% 88.4% 发情时间 注射后48~96h 撤栓后36~72h 撤栓后36~48h 同期化程度 发情率均匀分布在注射后48~96h 85%以上在撤栓后48h内发情 95%以上在撤栓后48h内发情 黄体合格率 86.3% 93.8% 82.5% 移植妊娠率 43.7% 58.3% 48.8% 优点 成本低 发情较集中，可精确安排工作量；受体牛利用率高 发情高度集中，可精确安排工作量 缺点 发情分散，不易精确安排工作量 成本高 *牛同期发情的目的是便于人工受精和胚胎移植，更适于集约化管理。 受体牛营养状况对同期发情效果有显著影响。

3. 胚胎冷冻技术 胚胎程序化冷冻(植冰): 进口胚胎检疫条例要求： 胚胎玻璃化冷冻(玻璃化溶液、提高降温速度)： 3. 胚胎冷冻技术 胚胎程序化冷冻(植冰): 1.5M乙二醇（0.1M蔗糖），直接解冻移植 进口胚胎检疫条例要求： 透明带完整； 0.1%胰蛋白酶洗10次； 在全封闭的细管中冷冻。 胚胎玻璃化冷冻(玻璃化溶液、提高降温速度)： OPS玻璃化冷冻 细管法 冷冻环法 滴冻法 微细玻璃管法、 封闭式拉长塑料细管法

4. 胚胎性别鉴定及控制技术 胚胎性别鉴定技术： 胚胎性别控制技术： PCR法（电泳和非电泳鉴定）： LAMP法： 4. 胚胎性别鉴定及控制技术 胚胎性别鉴定技术： PCR法（电泳和非电泳鉴定）： 双引物一步法PCR扩增，耗时65分钟。灵敏度、准确率高、污染率和不反应率低，适于在生产现场应用。 2002年，Hasler对7-8日龄的3,964枚体内胚胎及1181枚体外胚胎进行了性别鉴定，在妊娠后经B超测试获得的准确率为雄性为98.7%、雌性为94.4%。 LAMP法： 环-媒恒温扩增法，比PCR法更为快速简便，无需电泳，肉眼即可辨别，但鉴定准确率不高，容易产生非特异性扩增。 胚胎性别控制技术： 用分离后的X或Y精子生产体内或体外受精胚胎

PCR胚胎性别鉴定与X精子胚胎性别控制技术 在奶牛中的应用效果比较 （体内受精冷冻胚胎，2002~2010年，李树静等） 胚胎类型 常规胚胎 PCR性别鉴定胚胎 X精子性别控制胚胎 特点   对受精后6－7天的早期胚胎进行取样，分析DNA 用分离后的精子输精，获得近90％性别一致的后代 超排获得的可用胚胎数量 5~6枚 (育成牛、经产牛) (非鉴定，育成牛、经产牛) 3~5枚 (育成牛) 得到一头母牛犊所需胚胎数量 5枚 5枚(非鉴定) 3枚(X性控胚胎) 得到一头母牛犊所需受体母牛数量 6头 3头 4头 移植妊娠率 45%~50% 35~45% 产母犊率 45~50% 95~99% 75~85% 获得1头6月龄母牛犊的成本 14260元 8140元人民币 6480元 优点 操作简便，可任意选择种公牛 准确率高，可任意选择种公牛 操作简便，雌性率较高 缺点 成本高，效率低 操作较烦琐，耗时长，成本高 对种公牛的选择有局限性

不同类型胚胎移植后对妊娠率和产犊情况的影响   移植 受体数 妊娠 妊娠率 (%) 产犊数 产母犊数 产母犊率 常规胚胎 380 117 46.58a 111 54 48.65a 性别控制胚胎 206 76 36.89a 71 53 74.65b 性别鉴定胚胎 231 104 45.02a 99 98 98.99c 注： i. 同一列数值中具有相同字母上标示差异不显著(P>0.05)； ii. 同一列数值中具有不同字母上标示差异极显著(P<0.01)。

个人观点 胚胎性别鉴定技术和精子分离性别控制技术是以胚胎移植和人工授精技术为基础衍生出的生物技术，它们强化了胚胎移植和人工授精的目的。 每项技术都有其特定的应用层面和定位，也有其特定的使用范畴。就象胚胎移植技术不可能取代人工授精技术一样，精子分离技术也不可能取代常规冻精生产，X精子生产的性控胚胎也不可能完全取代性别鉴定后的雌性胚胎。 每项技术都有其长处，也有其不尽人意的地方，应该深入研究、取长补短、共同发展。

5. 活体采卵及体外受精技术 成年牛活体采卵（OPU）技术： 幼畜超排活体采卵技术： 幼畜超排活体卵的体外受精技术 盲采法 内窥镜法 5. 活体采卵及体外受精技术 成年牛活体采卵（OPU）技术： 盲采法 内窥镜法 B型超声波导引法 卵子回收数为6.04枚每头每次，卵母细胞回收率为42.9％ 幼畜超排活体采卵技术： IVF体外受精技术水平：囊胚率在40%左右（43%，阳年生等） OPU体外受精技术水平：囊胚率在30%左右 幼畜超排活体卵的体外受精技术

体内受精胚胎与体外受精胚胎的应用效果分析 胚胎类型 常规体内受精胚胎 IVF胚胎 OPU胚胎(成年牛) 生产效率 5~6枚/头/次 工厂化批量生产 1~2枚/头/次 移植妊娠率 与人工授精情期受胎率接近(40~60%) 远低于人工授精情期受胎率 10~30% 远低于人工授精情期受胎率10~30% 优、 缺点比较 系谱完整，可按需要选择父本、母本 缺乏母亲系谱，只可选择公牛 ET后代可做核心育种群及种公牛 可能产生杂种，ET后代不能做种用，只能补充生产群 胚胎成本高，受体牛饲养成本合理 胚胎成本低，受体牛饲养成本高 胚胎成本高，受体牛饲养成本高 适用范围 洲际引种、良种快速扩繁 胚胎工程试验材料 挖掘老龄、幼龄优秀个体的繁殖潜力

6. 胚胎分割技术 1979年由英国剑桥家畜研究所的威拉德森(Willadsen)最早研究成功，先后得到一卵双胎、三胎甚至四胎的克隆绵羊以及克隆牛和马等 1987年窦忠英等以黄牛作受体，奶牛胚胎二分割移植妊娠率为50%； 1990年窦忠英等得到国内首例胚胎四分割同胚三犊，四分胚移植妊娠率为50%；谭丽玲，吴德国等分割7~ 8天奶牛胚胎 ，裸半胚成对移植，获得29.1%半胚产犊率 和41.7%双胎率 。 目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展

双半胚、全胚移植效果比较(李树静等，2009年） 类型 移植 头数 妊娠 产犊受体头数 产犊数 双胎数(对) 成活 妊娠率 (%) 成活率 鲜双半胚 20 17 15 25 10 85.00%a 68.00%a 鲜全胚 52 33 29 55.77%b 100.00%b 注： 同一列数值中具有相同字母上标表示差异不显著(p>0.05)。 同一列数值中具有不同字母上标表示差异极显著(p<0.01)。

7. 提高受体移植妊娠率 移植妊娠率是奶牛胚胎移植产业化应用中关键因素 7. 提高受体移植妊娠率 移植妊娠率是奶牛胚胎移植产业化应用中关键因素 受体牛营养状况对移植妊娠率影响显著；季节、胚胎质量、冷冻、取样对移植妊娠率无显著影响 提高受体移植妊娠率的研究 干扰素 滋养层组织

第二部分 奶牛胚胎移植技术 产业化发展历程

何为产业化？ 经济学定义： 全国科学技术名词审定委员会： 是指要使具有同一属性的企业或组织集合成社会承认的规模程度，以完成从量的集合到质的激变，真正成为国民经济中以某一标准划分的重要组成部分。 全国科学技术名词审定委员会： 将所设计和实施的胚胎生物工程，形成为创造和满足人类经济需要的物质和非物质性生产的、从事盈利性经济活动并提供产品和服务的产业。

里程碑事件 1951年，美国诞生了第一头胚胎移植犊牛 1971年，首家家畜胚胎移植商业公司成立（Alberta 家畜胚胎移植有限公司，加拿大） 1972年，Sugie设计的带有气囊装置的非手术采卵技术获得成功 1974年，第一头胚胎移植登记的荷斯坦奶牛在美国出生 1975年1月，国际胚胎移植学会（IETS）成立 (美国科罗拉多州丹佛市) 1976年，奶牛的非手术法移植获得成功 1979年，法国诞生了第一头胚胎牛，并于当年成立了欧洲第一家胚胎移植公司 1988年，爱尔兰建立全世界第一家生产体外受精胚胎的公司 Ovamass 牛非手术采卵和移植技术的成功使操作程序大大简化，减少了因为手术对供体、受体母牛的伤害，使奶牛的胚胎移植迅速得到推广并于1977年开始进入商业化应用。 里程碑事件

发展规模及速度 国外牛胚胎移植技术发展规模及速度 年度 区域 生产ET牛犊规模 品种 注册登记的ET奶牛头数 运作形式 1978年 北美 近1万头 奶牛、肉牛 ----- 完全商业化 1980年 近10万头 30%奶牛、70%肉牛 8298头 1991年 全世界 移植240730头 18727头 （北美） 1996年 移植412573头 142598头（美国） 2002年 移植50万头 奶牛、肉牛（北美36万头奶牛）  

表6 我国牛胚胎移植技术发展规模及速度 年度 发展阶段  生产规模 运作形式 1978~1990年 实验室研究阶段 ----- 国家及省市研究项目资助 1991~1995年 中试阶段 每年生产移植犊牛几百头 国家重大科技项目资助 1998~2001年 产业化初期 2002年 移植近万头 农业部“万枚高产奶牛胚胎移植富民工程”资助 2003~2009年 产业化中期 每年生产移植犊牛几千头 国家引种专项经费 养殖户和省政府共同筹资（河北） 企业自筹（河北、黑龙江、海南、辽宁等）

中国与加拿大2008年、2009年奶牛胚胎移植规模比较 内容 中国 (2008)* 加拿大 中国(2009)* (2009) 供体头数（头） ≈4000 11092 11059 可用胚胎采集总数（枚） ≈20000 70571 74828 冷冻胚胎总数（枚） 47739 49535 常规鲜胚移植总数（头） ？ 21256 22626 性别鉴定鲜胚移植总数（头） ≈100 1208 1469 常规冻胚移植总数（头） ≈1500 19988 ≈1000 23503 性别鉴定冻胚移植总数（头） 1283 1619 胚胎出口总数（枚） ----- 8883 8901 胚胎进口总数（枚） ≈2000 94 89 生产OPU胚胎总数（枚） 650 564 生产离体卵巢 体外受精胚胎总数（枚） 3200 IVF鲜胚移植总数（头） 299 206 IVF冻胚移植总数（头） 3 *没有确切的统计数字。？不确定是否做过该项工作和所做的数量。

应用范畴 扩繁优秀母牛： 快速生产优质种公牛： 以胚胎代替活畜引种： 1990年的统计，美国荷斯坦奶牛核心群母牛的27.5% 和优秀种公牛的44% 来自胚胎移植产生的后代。 快速生产优质种公牛： 目前，北美地区、法国参加后裔测定的青年公牛85% 以上的是胚胎移植后代。 以胚胎代替活畜引种： 目前，北美向全球每年出口牛胚胎达29,000枚；我国 每年引进牛胚胎1,500~2000枚。

制约我国奶牛胚胎移植技术产业化发展的瓶颈 行业不规范 成本高 尚未形成规范的系谱登记和发行、种公牛排名、 后裔测定、DHI测定体系 加拿大：LPI(Lifetime Profit Index ) 美国：TPI (Total Performance Index) 美、加： Official Pedigree online 尚未形成市场化推动的种牛拍卖会等商业活动 加拿大： National Holstein Shows（Holstein Association Canada，每年2次）

国内外奶牛胚胎移植技术产业化应用效果分析 在北美，80%以上的奶牛场做过胚胎移植，在加拿大40－50%的 奶牛场一直坚持做胚胎移植，他们把自家牛群中生产性能最好、遗 传性能最强的母牛选为供体，选择在美国和加拿大排名前50名的种 公牛精液来生产胚胎，移植到自家的育成牛中，使育成牛的第一胎 生产高产奶牛的后代。这样待育成牛第一胎产奶生产性能测定出结 果后，即可决定该牛是进入核心群、生产群，还是被淘汰。 美国的年奶产量在10年内上升上了20%，而同期的母牛头数却下 降了10%，胚胎移植技术对其贡献率占70%以上。美、加两国排 名前100名的种公牛中90%以上是胚胎移植的后代。 2002年全世界共移植奶牛性别鉴定雌性胚胎6700例，其中加拿大 为4700例，美国为2000例。 自2002年以来，全世界每年生产10~15万枚奶牛体外受精胚胎， 其中源自活体采卵的体外受精胚胎不足1000枚；每年移植奶牛体 外受精胚胎不足1000头，以活体采卵的体外受精胚胎为主。

国内外奶牛胚胎移植技术产业化应用效果分析 北京安伯胚胎生物技术中心2005~2009年性别鉴定胚胎移植结果(河北)   移植头数 妊娠头数 妊娠率(%) 产犊数 产母犊数 产犊准确率(%) 2005年 2664 1194 44.82 1132 1110 98.06 2006年 4136 1959 47.36 1871 1838 98.24 2007年 4586 2338 50.98 2310 2276 98.53 2008年 3662 1949 53.22 1901 1872 98.47 2009年 2841 1509 53.12 811* 802* 98.89* Total 17889 8949 50.03 8025 7898 98.42 注：“*”代表该数据为不完全统计的部分数据(截至完稿时2009年胚胎移植的产犊未结束)

奶牛胚胎移植技术的效益体现在哪儿？ 国内品种荷斯坦奶牛与性别鉴定胚胎移植后代的产奶性能统计 胎次 品种来源 头数 产奶量(kg) 乳脂率(%) 乳蛋白率(%) 2 国产奶牛 65 6,703±143a 3.2~3.4 2.8~3.0 性别鉴定胚胎移植后代 38 9,506±189b ≥4.0 ≥3.2

奶牛胚胎移植技术的效益体现在哪儿？ 性别鉴定胚胎移植对母牛群体扩繁的影响 母牛类型 母牛头数 全年受胎率(%) 产犊头数 母犊头数 母犊率(%) 育成牛* 205 94.63(194/205)a 183 132 72.13a 经产牛 149 89.93(134/149)a 129 62 48.06b 总计 354 92.66(328/354)a 312 194 62.18 注： 同一列数值中具有相同字母上标表示差异不显著(p>0.05)。 同一列数值中具有不同字母上标表示差异极显著(p<0.01)。 同一列数值中具有相同字母不同大小写之间表示差异显著(p<0.05) *表示胚胎移植结合人工授精的繁育技术路线。

发展模式 高产奶牛 优秀种公牛 超数排卵 常规冻精 X 冻 精 性控雌性体内胚胎 性鉴雌性体内胚胎 性鉴雄性体内胚胎 常规胚胎 性别鉴定 胚胎组织块 移植到各地区同期发情的合格受体牛 对应的胚胎冷冻解冻技术 高 产 优 质 母 牛 犊 计算机管理系统

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