2006届硕士学位论文答辩会

姜黄素对人鼻咽癌放射残存细胞株CNE-2Z-Tr12 增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响 硕士学位论文答辩 姜黄素对人鼻咽癌放射残存细胞株CNE-2Z-Tr12 增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响 研究生：范德生 导 师：孙 宁 教授 广东医学院病理教研室 2006.6.16

硕士学位论文答辩 第一部分 研究背景

鼻咽癌的特点 1. 地域分布(两广、湖南） 2. 病变及治疗特点（位置、放疗） 3. 鼻咽癌患者主要死亡原因（复发、转移） 研究背景 鼻咽癌的特点 1. 地域分布(两广、湖南） 2. 病变及治疗特点（位置、放疗） 3. 鼻咽癌患者主要死亡原因（复发、转移） 因此，在华南地区研究放射后存活鼻咽癌 细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡问题具有 重要的意义

放射后存活鼻咽癌细胞 研究表明: 1. 辐射可以导致肿瘤细胞线粒体DNA4977bp特异性缺失 研究背景 放射后存活鼻咽癌细胞 研究表明: 1. 辐射可以导致肿瘤细胞线粒体DNA4977bp特异性缺失 2. 具有辐射抗性的肿瘤细胞多具有EGFR过表达的特性

细胞侵袭、运动与 细胞微绒毛、细胞骨架 微绒毛在癌细胞侵袭早期起重要作用，具有黏附、运动、吸收、吞噬、支持等多种作用 研究背景 细胞侵袭、运动与 细胞微绒毛、细胞骨架 微绒毛在癌细胞侵袭早期起重要作用，具有黏附、运动、吸收、吞噬、支持等多种作用 细胞的侵袭、运动与细胞骨架成分、微丝微管分布及相关信号传导通路有关

EGFR与肿瘤 1. EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡密切相关 研究背景 EGFR与肿瘤 1. EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡密切相关 2. 研究表明EGFR与细胞骨架微丝成分(F-actin)直接结合

研究背景 EGFR与细胞骨架 EGF 和EGFR结合后通过相关信号传导通路激活细胞骨架，产生对细胞骨架重构、移动、成分变化等多种影响作用，改变肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力等生物学特性

姜黄素抗肿瘤研究现状 研究发现姜黄素可以： 1 调控癌基因、抑癌基因 2 引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡 3 抑制肿瘤血管生成，降低转移率 研究背景 姜黄素抗肿瘤研究现状 研究发现姜黄素可以： 1 调控癌基因、抑癌基因 2 引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡 3 抑制肿瘤血管生成，降低转移率 4 抑制 EGFR-PI3K-PKC 通路 5 本室对其抗鼻咽癌机理已有一定研究

硕士学位论文答辩 第二部分 研究目的

姜黄素抗鼻咽癌研究 1. 本室证实姜黄素能够抑制H5细胞的增殖, 但 其能否抑制Tr12细胞的增殖? 通过什么机制 研究目的 姜黄素抗鼻咽癌研究 1. 本室证实姜黄素能够抑制H5细胞的增殖, 但 其能否抑制Tr12细胞的增殖? 通过什么机制 2. 能否抑制Tr12细胞的侵袭、迁移, 可能机制 3. 能否诱导Tr12细胞的凋亡，可能机制 4.是否能通过细胞骨架的破坏对鼻咽癌细胞起 到杀伤作用

姜黄素与放射增敏 1. 本室对其放射增敏作用已有一定研究 研究目的 1. 本室对其放射增敏作用已有一定研究 2. EGFR的表达程度与肿瘤的放射抵抗性呈正相关，如果姜黄素能够抑制EGFR的表达，则可能影响相关传导通路，从而起到放射增敏作用

硕士学位论文答辩 第三部分 技术路线

技术路线 CNE-2Z细胞 Tr12细胞 PCR RT-PCR mtDNA4977bp EGFR mRNA

Tr12细胞 技术路线 MTT 对 照 组 姜 黄 素 组 10μ 姜 黄 素 组 20μ 姜 黄 素 组 40μ FCM 光镜 SEM Western-Blot RT-PCR 周期 侵袭、运动 实验 细胞 形态 骨架 EGFR 绒毛、凋亡 凋亡率 BCL-2

硕士学位论文答辩 第四部分 结果与讨论

结果 讨论 一、Tr12细胞生物学特性

CNE-2Z、Tr12细胞 mtDNA 的PCR结果 结果 讨论 mtDNA4977bp缺失的检测： M Tr12 Tr12 2Z 2Z CNE-2Z、Tr12细胞 mtDNA 的PCR结果 676bp

CNE-2Z、Tr12细胞EGFR mRNA 的RT-PCR结果 结果 讨论 EGFR mRNA的检测： 2Z Tr12 M CNE-2Z、Tr12细胞EGFR mRNA 的RT-PCR结果 676bp 377bp

EGFR mRNA的检测： CNE-2Z、Tr12细胞EGFR mRNA 的RT-PCR结果 结果 讨论 (Independent Samples t-Test)： t=4.972, P＜0.05

讨 论 放射可以特异性诱导mtDNA 4977bp缺失；而某些类型的肿瘤也存在mtDNA4977bp缺失；吸烟、老龄化也有诱发此缺失的倾向 讨 论 结果 讨论 放射可以特异性诱导mtDNA 4977bp缺失；而某些类型的肿瘤也存在mtDNA4977bp缺失；吸烟、老龄化也有诱发此缺失的倾向 Tr12细胞不存在mtDNA4977bp缺失原因

讨 论 EGFR的表达程度与肿瘤的放射抵抗性呈正相关, EGFR高表达的肿瘤放、化疗预 后不良 讨 论 结果 讨论 EGFR的表达程度与肿瘤的放射抵抗性呈正相关, EGFR高表达的肿瘤放、化疗预 后不良 以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗在临床试验中取得了令人振奋的结果，这种方法主要针对EGFR高表达的肿瘤

讨 论 CNE-2Z、Tr12细胞EGFR mRNA均高表达， Tr12细胞表达强于CNE-2Z 讨 论 结果 讨论 CNE-2Z、Tr12细胞EGFR mRNA均高表达， Tr12细胞表达强于CNE-2Z 推测CNE-2Z细胞由于辐射引起一系列反应，造成Tr12细胞EGFR表达更高，也由此导致其辐射抗性、侵袭、运动能力增强等生物学特性的改变

二、姜黄素对Tr12细胞增殖、侵袭、迁移的影响 结果 讨论 二、姜黄素对Tr12细胞增殖、侵袭、迁移的影响

结果 讨论 MTT实验结果 MTT结果 在同一时间范围内，各组间差异有显著意义（P＜0.001）, F值分别为71.970，302.015。

姜黄素对Tr12细胞周期的影响

One-Way ANOVA analysis, Compare with 姜黄素对Tr12细胞周期的影响 姜黄素对Tr12细胞周期的影响（％） Group G0/G1 S G2/M 0 µmol/L 66.10±0.90 15.80±0.19 18.10±1.10 10µmol/L 65.20±1.45* 31.40±1.75* 3.20±0.30* 20µmol/L 39.70±0.35* 22.30±0.95* 37.60±1.29* 40µmol/L 57.20±2.00* 19.60±1.39* 23.50±1.39* One-Way ANOVA analysis, Compare with 0 concentration* : P＜0.01

Tr12细胞侵袭实验结果 结果 讨论 0 µmol/L 10 µmol/L 20 µmol/L 40 µmol/L

One-Way ANOVA analysis 结果 讨论 Tr12细胞侵袭实验结果 侵袭实验结果 One-Way ANOVA analysis F=22.443, P＜0.001

Tr12细胞运动实验结果 结果 讨论 0 µmol/L 10 µmol/L 20 µmol/L 40 µmol/L

One-Way ANOVA analysis 结果 讨论 Tr12细胞运动实验结果 运动实验结果 One-Way ANOVA analysis F=39.214, P＜0.01

Tr12细胞微绒毛(SEM) 结果 讨论 0 µmol/L 10 µmol/L

Tr12细胞微绒毛(SEM) 结果 讨论 20 µmol/L 40 µmol/L

结果 讨论 T12细胞骨架实验结果 0 µmol/L 10 µmol/L

结果 讨论 T12细胞骨架实验结果 20 µmol/L 40 µmol/L

结果 讨论 对Tr12细胞EGFR mRNA表达的影响 40 20 10 0 M RT-PCR结果 858bp 500bp 377bp

One-Way ANOVA analysis 结果 讨论 对Tr12细胞EGFR mRNA表达的影响 RT-PCR结果 One-Way ANOVA analysis P＜0.001

讨 论 MTT结果显示姜黄素可以呈剂量依赖性地抑制Tr12细胞的增殖 讨 论 结果 讨论 MTT结果显示姜黄素可以呈剂量依赖性地抑制Tr12细胞的增殖 FCM结果显示：姜黄素处理后，Tr12细胞阻滞于S期和/或G2/M 期, 两者都可使整个细胞周期延缓或中断而影响其增殖 FCM结果未显示明显的凋亡峰

讨 论 Transwell小室实验结果分析：比较直观的显示了姜黄素对Tr12细胞的抗侵袭活性 ，并能抑制其运动能力 讨 论 结果 讨论 Transwell小室实验结果分析：比较直观的显示了姜黄素对Tr12细胞的抗侵袭活性 ，并能抑制其运动能力 SEM结果分析：微绒毛是细胞质骨架在细胞表面的特化结构（F-actin) ，姜黄素可能通过对微绒毛的作用抑制Tr12细胞侵袭、迁移

讨 论 结果 讨论 微丝 微管 信号传导 分布改变 生化成分 RT-PCR结果分析：EGFR表达降低通过相关信号传导通路引起细胞骨架的改变，使细胞的侵袭、运动能力减弱而降低肿瘤的转移能力，这可能是姜黄素抑制肿瘤细胞侵袭、迁移的具体机制之一 放疗与起到EGFR抑制作用的药物（例如姜黄素）联用

结果 讨论 三、 姜黄素对Tr12 细胞凋亡的影响

结果 讨论 SEM实验结果 10 µmol/L 20 µmol/L

结果 讨论 SEM实验结果 40 µmol/L 40 µmol/L

结果 讨论 Annexin V FITC/PI 双染结果 0 µ 10 µ 20 µ 40 µ

结果 讨论 Tr12细胞凋亡率 Annexin V FITC/PI 双染结果

Tr12细胞BCL-2的表达 Western-Blot 结果 结果 讨论 0 10 20 40 28kD BCL-2 42kD 0 10 20 40 Western-Blot 结果 28kD BCL-2 42kD β-actin

结果 讨论 Tr12细胞BCL-2的表达 Western-Blot 结果

讨 论 凋亡本身是形态学的概念。电镜下大量外膜完整、大小不一的凋亡小体证实：凋亡存在 讨 论 结果 讨论 凋亡本身是形态学的概念。电镜下大量外膜完整、大小不一的凋亡小体证实：凋亡存在 双染FCM 结果分析：各组Tr12细胞存在不同程度的凋亡，与剂量相关，可能与姜黄素抑制BCL-2表达有关；高浓度时细胞直接坏死，可能与细胞骨架破坏有关 抑制BCL-2的表达可增强肿瘤细胞对化疗及放疗的敏感性

讨 论 PI染色FCM检测凋亡的局限性 PI染色检测的是细胞DNA的含量，凋亡早期胞膜通透性增加并不明显，可能没有DNA的丢失 讨 论 结果 讨论 PI染色FCM检测凋亡的局限性 PI染色检测的是细胞DNA的含量，凋亡早期胞膜通透性增加并不明显，可能没有DNA的丢失 凋亡和细胞周期：亚二倍体峰的主要来自处于G0/G1期的凋亡细胞，但一旦凋亡途径被激活，各个阶段的细胞都有可能被诱导凋亡 如果药物是针对G0/G1的，那么可能会有较明显的亚二倍体峰。如果是G2/M期和/或S期阻滞的药物，如紫杉醇、姜黄素等，那么凋亡峰则可能不明显

小 结 本结果为已进入临床实验的以EGFR为靶点的治疗方法在鼻咽癌的临床应用提供了实验依据；Tr12细胞EGFR mRNA表达更高，这可能与肿瘤细胞的辐射抗性和演进有关 2. 姜黄素可以抑制Tr12细胞的增殖、侵袭、运动，这可能与姜黄素对细胞周期、微绒毛、EGFR的表达及细胞骨架的影响相关

小 结 姜黄素可以诱导Tr12细胞的凋亡，从蛋白水平抑制 bcl-2的表达可能是其作用机制之一，超过一定浓度的姜黄素可以直接引起Tr12细胞坏死 4. 姜黄素对放射后存活鼻咽癌细胞显示了良好的抑制、诱导凋亡及体外杀伤作用，丰富了放疗后复发鼻咽癌化疗及放疗增敏的研究内容。

致 谢 感谢导师孙宁教授 感谢唐慰萍教授、陈小毅教授、胡新荣教授、姚运红副教授、姜汉国副教授、曹军主任医师、赵颖海副教授、熊晖、林琼燕师姐 致 谢 感谢导师孙宁教授 感谢唐慰萍教授、陈小毅教授、胡新荣教授、姚运红副教授、姜汉国副教授、曹军主任医师、赵颖海副教授、熊晖、林琼燕师姐 感谢邓惠华高级实验师、蔡琼珍、李飞虹、罗伯涛、揭伟、唐加步、唐泽立、包刚等各位老师 感谢附院黄应桂主任和病理科全体老师 感谢师兄、师姐、同窗好友和师弟、师妹，友谊地久天长 最后，深深感谢我的家人给予我的最无私的爱

敬请各位老师批评指正！ 谢谢！