乙型肝炎病毒准种特征 及其临床意义 张欣欣 上海瑞金医院感染科 中文幻灯制作者：同济医院感染科李维娜医师

HBV 具有高复制率，其多聚酶缺乏校正功能

HBV 以具有不同适应度的准种形式存在 Domingo E. Curr Top Microbiol Immunol. 2006 （1）病毒种群是一个变异的谱系。 （2）变异谱系包括了有利于提高病毒适应性的表型变异。不同的病毒亚群具有生物学上的关联性，不同的变异可以共存于同一个宿主体内。 （3）变异谱系中的不同组分表现出不同的适应水平。 （4）病毒群体的适应性变化取决于病毒群体的大小和环境的变化。适应性的变化梯度决定了病毒群体在序列空间中的变化方向。 （5）在准种的动态变化中，有害的、中性的和有益（自身或补偿性）的突变都可以发生在突变谱系的任何组分之中。突变的性质取决于病毒复制所处的环境以及序列的背景（包括单个基因组水平和所处的变异谱系水平）。 （6）一个广阔的变异谱系有利于提高病毒的适应能力。而变异谱系太宽或太窄都有损于病毒的适应能力 （7）变异速率超过一定的的阈值将导致病毒感染能力的丧失。 （8）变异谱系可以通过正向作用（互补）或负向作用（干扰）来调节病毒的生物学行为。 （9）占据主导作用的负向作用将导致病毒的灭亡。 （10）一个高适应性的变异可以被一群低适应性的变异谱系所抑制。 （11）当一个低适应性的病毒处于适应性变化曲线的平台期，而一个高适应性的病毒处于适应性变化曲线的高峰期时，前者比后者能够承受更进一步的变异。 Domingo E. Curr Top Microbiol Immunol. 2006

HBeAg-/anti-HBe+ (前C/C 启动子变异株) 慢性HBV感染分期 免 疫 免 疫 低复制 活动 耐 受 清 楚 期 期 HBeAg+ HBeAg-/anti-HBe+ (前C/C 启动子变异株) < > < > > 2000 IU/mL HBV DNA < 2000 IU/mL 2 x 108 - 2 x 1011 IU/mL 200,000 - 2 x 109 IU/mL ALT, alanine aminotransferase; anti-HBe, antibody to hepatitis B e; CH, chronic hepatitis; HBeAg, hepatitis B e antigen. Finally, this section shows the HBeAg-positive phase, the inactive carrier phase, and the HBeAg-negative phase. It should be highlighted that a patient can move from the HBeAg-positive to HBeAg-negative phase with either no or a very brief period of the inactive carrier state.   ALT 正常/轻度 CH 中度/重度 CH 正常/轻度 CH 中度/重度 CH 肝硬化 非活动性肝硬化 肝硬化 HBeAg+ 慢性肝炎 非活动性携带状态 HBeAg- 慢性肝炎 4 Slide courtesy of A. S. F. Lok, MD. 4 4 4

未治疗CHB病人HBV逆转录酶区的特征 to investigate prevalence of primarily existed nucleot(s)ide analogue related mutants in Chinese treatment naive chronic hepatitis B patients. to construct a reverse transcriptase (RT) sequence database in these patients for further studies of HBV. 350 CHB from 5 cities of China were involved in this study. The mixed strains of different sites were found in many samples, which may become dominant strains under the anti-viral therapy and lead to drug resistance. As dominant strains：M204V/I/S 1.8%, A181T/V 0.6%, 181,236 as mixed strains：5.5% 5

未经治疗CHB病人 HBV RT区的特征 Shanghai Wuxi Shengzhen Anhui Jilin Total major minor major minor major minor major minor major minor major minor Han Y et al. Journal of Gastroenterology and Hepatology 24 (2009) 1417–1423

不同临床转归病人的准种特征 准种复杂度 准种离散度 d: 平均遗传距离, Hamming 距离 （Shanon 熵, Sn) Sn =-∑i(pilnpi)/lnN 准种离散度 d: 平均遗传距离, Hamming 距离 dS: 平均同义替换位点数 dN: 平均非同义替换位点数 准种复杂度，也称为香农熵(Shannon entropy, Sn),指的是在同一个病毒群体里不同的病毒基因组所占的比例。N是所有克隆的总数，pi是病毒群体中每一种准种序列出现的频率。 平均遗传距离，也称为Hamming距离，指的是在病毒群体里任意两个不同序列之间的平均核苷酸变异数量，所有两两间的平均核苷酸变异数量的平均值反映了准种的遗传复杂度。 平均同义替换位点数（dS）指的是编码蛋白质的核苷酸序列上所有可能发生同义替换的位点上所实际发生的平均同义替换的核苷酸数目。由于同义替换并不改变所编码的氨基酸的性质，因此dS代表了“沉默”突变的数量。平均非同义替换位点数（dN）指的是编码蛋白质的核苷酸序列上所有可能发生非同义替换的位点上所实际发生的平均非同义替换的核苷酸数目。由于非同义替换将改变所编码的氨基酸的性质，因此dN代表了“替代”突变的数量。

不同临床转归病人的临床特征 年龄：ASC小于AHB和CSHB 性别：CHB的男性比例小于CSHB组 HBeAg：AHB有4个为（+ +），CHB组中有1例，CSHB组与其余三组有差 Huang SuYuan, ….Zhang Xin Xin et al. EASL 2011 poster (young investigator award)

不同临床转归结局的病人血清中 HBV全基因组准种特点 Huang SuYuan, ….Zhang Xin Xin et al. EASL 2011 ,poster (young investigator award)

HBV S 基因的准种特点

已治愈的CSHB病人准种复杂度较低 遗传离散度没有差异 Huang SuYuan, ….Zhang Xin Xin EASL 2011 ,poster (young investigator award)

HBV preC/C基因准种特点

preC 和BCP变异：T1753C、A1762T/G1764A、C1766T、G1896A， CSHB>CHB>AHB>ASC G1896A，形成终止密码子后终止了HBeAg的翻译，使血清学表现为HBeAg阴性①HBeAg与HBcAg免疫交叉；②使前基因组RNA结构更稳定，从而上调C基因的表达和DNA的复制；③使HBcAg由核型转化为胞浆型。以上3点均可由于G1896A突变后HBeAg表达减少或缺失，HBV复制增加、受感染肝细胞损伤加重，肝功能下降. G1896A突变联合A1762T/G1764A突变，HBeAg表达减少或缺失， C基因的表达上调，HBV复制增加、受感染肝细胞损伤加重，病情加重。 Huang SuYuan, ….Zhang Xin Xin et al. EASL 2011 ,poster (young investigator award)

HBV P 基因的准种特点

不同分期的慢性HBV感染患者RT区准种特点 LC CASC CHB n=8 n=6 n=30 年龄(岁) 47.5（36～61） 26.83（22～31） 38.13（20～65） 性别（男/女） 6/2 5/1 25/5 HBeAg（+/-） 6 30 genotypes（C/B） 7/1 4/2 18/12 ALT（IU/L） 107.8（16～453） 34.5（18～47） 140（52～319） HBV-DNA(log10 cp/ml) 6.23(4.05～7.90) 7.82(7.46～8.52) 8.39(5.94～9.59) LC：肝硬化 CASA：慢性无症状HBsAg 携带者 CHB: 慢性乙型肝炎 Yao BL,…Zhang XX. Chinese J Infectious Diseases 2011，29：717-22 .

肝硬化病人RT区准种复杂度最高 Complexity nt Complexity aa Nt aa LC：肝硬化 CASA：慢性无症状HBsAg 携带者 CHB: 慢性乙型肝炎 Yao BL,…Zhang XX. Chinese J Infectious Diseases 2011，29：717-22 .

肝硬化患者RT区准种离散度最高 Nt level aa level LC：肝硬化 CASA：慢性无症状HBsAg 携带者 CHB: 慢性乙型肝炎 Yao BL,…Zhang XX. Chinese J Infectious Diseases 2011，29：717-22 .

抗病毒治疗时准种的进化 未治疗 抗病毒治疗 尽早地预测抗病毒治疗疗效以及预防耐药的发生是提高抗病毒疗效的重要策略。HBV是以准种形式存在于体内,抗病毒治疗过程中药物的压力成为病毒准种动力学变化的主要筛选动力，反过来病毒准种异质性在治疗过程中的变化，也对抗病毒疗效产生了直接的影响，在抗病毒耐药变异发展过程中HBV分子进化起到了重要作用。 ???

拉米夫定治疗过程中HBV准种的早期变化及其对抗病毒疗效的预测意义 Chen Li,… Zhang XinXin. 2009 J Hepatol

第四周时，应答患者准种复杂度 低于非应答患者 在基线水平，应答者和无应答者的准种复杂性和离散度无显著差异 (P>0.05) 治疗4周时，应答者的准种复杂性明显低于无应答者(P<0.01) Chen L, et al. Journal of Hepatology, 2009, 50: 895-905.

治疗4周时，应答者的准种的遗传距离 明显低于无应答者 在基线水平，应答者和无应答者的遗传距离无显著差异 (P>0.05) 治疗4周时，应答者的准种的遗传距离明显低于无应答者(P<0.01) Chen L, et al. Journal of Hepatology, 2009, 50: 895-905.

治疗4周时，应答者的dS和dN明显低于无应答者 在基线水平，应答者和无应答者的同义置换率（dS）和非同义置换率（dN）无显著差异 (P>0.05) 治疗4周时，应答者的dS和dN明显低于无应答者(P<0.01) Chen L, et al. Journal of Hepatology, 2009, 50: 895-905.

不同选择压力下HBV RT区准种的早期变化 2 不同选择压力下HBV RT区准种的早期变化 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277

ETV治疗早期HBV RT 区准种的进化 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277 3 组间：基线无差别，4周时应答组低于部分应答组 组内：应答组4周时低于基线 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277

ETV治疗早期HBV RT 区准种的进化 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277 4 应答组：复杂度下降,部分应答组：复杂度上升 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277

ETV治疗早期HBV RT 区准种的进化 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277 5 离散度的净变化：应答组较高 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277

ETV 完全应答者进化率高于部分应答患者 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277 P = 0.012 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277

HBV准种进化模型用于预测病毒应答 7

8 ETV 应答预测模型 P =

LAM 治疗应答预测模型

不同选择压力下HBV的准种 10 Responders Partial Responders/Non-responders

LAM 应答者准种复杂度减低明显 强于ETV 应答者 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277

不同的选择压力下HBV准种的进化模式 可能不同 LAM 204 Genetic Barrier 184/202/ 250 180 204 Genetic Barrier

NAs耐药的可能新机制 共同点：复杂度增加 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277 通过基因屏障可能性增大 药物耐药 更多候选变异株储备 变异株作用空间增大 准种更复杂 Liu F, ..Zhang XX. Gut, 2011, 60:1269-1277

抗病毒治疗耐药全国监测网络 267 hospitals from 31 provinces involved http://lifecenter.sgst.cn/hbv/ 35

总结 处于不同临床阶段及不同选择压力下、或具有不同临床转归的病人，其乙肝病毒准种的进化模式并不相同 这可能与疾病及抗病毒耐药的发病机制有关，尚待进一步深入研究。