分子医学与分子医学技术 周 俊 宜 基础医学院生化教研室

分子医学概述

生命的螺旋

分子医学 虽然目前基因技术大多数尚待完善，其发展和应用的前景却未可限量，这使人们看到了可以拥有一个更加美好世界的可能性。 从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防和治疗疾病、鉴定身份，器官再造，运用基因技术防止新生儿疾病甚至设计更加“完美”的新生儿，培育新的动植物品种…… 虽然目前基因技术大多数尚待完善，其发展和应用的前景却未可限量，这使人们看到了可以拥有一个更加美好世界的可能性。 但另一方面，随着基因技术日益深入、广泛地干预生命，许多人也产生了诸多忧虑，从伦理、道德、法律、社会的角度来重新审视基因技术的应用。

1994年2月，美国国立卫生研究院((NIH) 卡普((Karp) , 布罗德((Broder) 《癌研究》 “分子医学的新方向 ”

1994年9月, 《Nature》杂志 “分子医学研讨会” “分子医学的挑战”

1995年 , 美国 《分子医学》杂志正式创刊 标志着现代生物医学进入分子医学新阶段  

发现控制正常细胞行为的基本分子 弄清基因异常与疾病发生的关系 通过检查和纠正这些异常基因对疾病进行 诊断、治疗和预防 根据卡普等的定义，分子医学的内容包括: 发现控制正常细胞行为的基本分子 弄清基因异常与疾病发生的关系 通过检查和纠正这些异常基因对疾病进行 诊断、治疗和预防 分子医学与传统医学的主要不同在于前者对疾病 的认识和操作都是在分子和基因水平上进行的。  

分子医学的基本内容: 疾病的分子机理   疾病的基因诊断   疾病的基因治疗   疾病的基因预防   分子医学的社会、伦理问题  

疾病的分子机理 探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。目前，医学对某些还缺少有效的治疗方法，就是因为对病因缺乏深入的认识。基因科学的发展，为人类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。

                                                                                                                                                                              维多利亚女王与尼古拉二世

                                                                                          英国女王维多利亚。她带有血友病的基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。

1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。

                                                                    美国毕晓普和瓦慕斯等人的研究表明：动物体内的癌基因不是来自病毒，而是由于在动物的正常细胞基因中本来就存在一个庞大的癌基因族，正常情况下这些原癌基因是不活跃的，但当受到病毒入侵或遇到物理、化学等因素作用时，就可能被激活，突变为癌基因。这也就解释了化学污染、吸烟、放射线辐射等因素致癌的原因。                                                                         

疾病的基因诊断 从广义上讲，大多数疾病都可以从遗传物质的变化中寻找出原因。而从技术上看，只要找到了与疾病相关的基因，基因诊断便立即可以实现。随着“人类基因组计划”的进程，将大大加快疾病相关基因的发现与克隆，基因诊断将成为疾病诊断的常规方法。   单基因疾病的诊断：一般可在临床症状出现之前作出诊断，不依赖临床表型； 有遗传倾向的疾病：易感基因的筛查，如高血压，冠心病，肥胖等。   外源性病源体：如病毒、细菌、寄生虫等引起的传染病，

美国前副总统汉弗莱<Humphrey) 在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞 良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。 九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。

1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了

基因鉴定技术 人体细胞有总数约为30亿个碱基对的DNA，每个人的DNA都不完全相同，人与人之间不同的碱基对数目达几百万之多，因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异，由此可以识别不同的人。所谓“DNA指纹”，就是把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同的人。由于DNA是遗传物质，因此通过对DNA鉴定还可以判断两个人之间的亲缘关系。 　　DNA鉴定技术是英国遗传学家A·J·杰弗里斯（1950－）在1984年发明的。由于人体各部位的细胞都有相同的DNA，因此可以通过检查血迹、毛发、唾液等判明身分。

DNA指纹                                                                                             只要罪犯在案发现场留下任何与身体有关的东西，例如血迹和毛发，警方就可以根据这些蛛丝马迹将其擒获，准确率非常高。DNA鉴定技术在破获强奸和暴力犯罪时特别有效，因为在此类案件中，罪犯很容易留下包含DNA信息的罪证。 　　根据DNA指纹破案虽然准确率高，但也有出错的可能，因为两个人的DNA指纹在测试的区域内有完全吻合的可能。因此在2000年英国将DNA指纹测试扩展到10个区域，使偶然吻合的危险几率降到十亿分之一。

疾病的基因治疗 基因疗法，即是通过基因水平的操作来治疗疾病的方法。目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细胞（如造血干细胞、纤维干细胞、肝细胞、癌细胞等），然后利用对人体无害的病毒当载体，把正常的基因嫁接到病毒上，再用这些病毒去感染取出的人体细胞，让它们把正常基因插进细胞的染色体中，使人体细胞就可以“获得”正常的基因，以取代原有的异常基因；接着把这些修复好的细胞培养、繁殖到一定的数量后，送回患者体内，这些细胞就会发挥“医生”的功能，把疾病治好了。

一个外科庸医正在从一个痴呆的精神病患者头上取出“愚人之石”，该画是16世纪博希所画，以讽刺那个时代人们的无知。但在基因时代，如果真能取出致病的基因，那么这名患者也许就有救了。                                                                                                                                                                                                                                                      

美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。                                                                          美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。                                                     1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。 谢德尔，1999

疾病的基因预防 1990年沃尔夫（WOff）等发现，将带有甲型流感病毒核蛋白编码基因的质粒注射到小鼠肌肉内，可使小鼠能经受致死剂量的甲型流感病毒的攻击。这种裸露的DNA通过滴鼻和肠道也可以进人细胞，并获得成功的保护性免疫。这种具有疫苗作用的裸露DNA称之为“基因疫苗”（gene vaccine）。

　 基因疫苗不仅可用于病毒感染，还可用于防治肿瘤，其主要优点为可以诱导很有效的专一性T杀伤性细胞，后者可以杀死肿瘤细胞。基因疫苗的安全性极高，一是无直接副作用，二是无间接副作用，不存在对人体的毒性，机体耐受性好，输注疫苗不引起其它疾患。1995年4月，经美国FDA批准进行了首例应用基因疫苗的人体临床试验。因而，可以看到其实际应用已指日可待了。

爱滋病基因疫苗

时钟基因与抗衰老 人类从公元3500年前就开始寻找长生不老药。老化的原因有多种因素，如蛋白质损伤、DNA损伤、细胞膜损伤、细胞内积累废弃物、端粒缩短等。 　　提升寿命上限的目标可以通过多种方法实现，除了治疗疾病、均衡营养、减少环境污染、适量运动等方法外，发掘控制衰老或长寿的基因成为最有潜力的途径之一。

“时钟基因”： 破坏“时钟1基因”（clock 1 gene）可使线虫的寿命延长1.5倍。科学家们发现，人类也有与时钟1基因大致相同的基因。 “年龄1基因”（age 1）、“daf-2”等受损会延长寿命的基因。人类的DNA中原来就有负责化解活性氧毒性的基因，我们也可以采取活化该基因的办法，以防止老化。 　 热量限制可以延长包括哺乳动物在内的许多物种动物的生命周期。限制热量摄入而延长生命的现象与一种叫作SIR2基因有关。 “我还活着”基因一旦发生改变，就会使果蝇寿命延长一倍。 人体内也存在这种基因，它是通过改变新陈代谢来发挥作用的。

                                                                         DNA缠绕成的染色体末端，有称做端粒（telomere）的区域。控制着细胞的分裂次数，端粒随着细胞分裂每次变短，短到某个程度，细胞将不再分裂。人的一生中，细胞大约能分裂50～60次。因此端粒是控制生理寿命的生物钟，而端粒长短就成为表示细胞“年龄”的指标。如果加入一种“端粒酶”阻止它缩短，就可使细胞保持年轻，人就像吃了“唐僧肉”一样实现长生不老的梦想。

分子医学的社会、伦理问题   分子医学与传统医学最根本的区别在于前者可在基因水平上对疾病进行操作。对遗传物质的操作可能引发的后果一开始就是科学界和公众关注的问题。早在70年代初，基因重组技术刚开始出现的时候，以美国著名分子生物学家伯格（Berg）为首的11名科学家共同呼吁禁止开展基因工程的研究，并得到了美国国立卫生研究院的赞同。  

科学家们对自己的研究工作可能产生的严重后果公开唤起公众的注意，这在科学史上还是第一次，说明科学家对遗传物质的操作所取的态度是极其谨慎的。 在那以后，利用基因工程技术在大肠杆茵中生产预定的蛋白质分子被证明是无害可行的，因而在80年代以来得到了迅速的发展，但将基因操作直接应用于人类疾病的治疗则与一般的基因工程不可同日而语。

分子医学常用技术

基因获取 基因检测 基因重组 基因表达 基因标记 基因探测 基因转移 基因信息

基 因 获 取

获取目标基因常常是基因操作的首要步骤。常规方法有PCR法，基因文库或cDNA文库法以及化学合成法。应根据具体的研究目的和实验条件选用合适的方法。

化学合成法 较短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物 测序引物 定点突变 核酸杂交探针

基因文库 基因组DNA 限制性内切酶 …… 克隆、转化、培养、鉴定 基因文库

PCR技术 引物 基因组 5’ 5’ 3’ 5’ 引物

引物设计： （1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制

循环仪 PCR技术的基本过程 TaqDNA聚合酶 94℃ 预变性 55 ℃ 72 ℃ 模板DNA dNTP 模板DNA dNTP 引物 引物 Buffer 模板DNA dNTP 引物 Buffer 94℃ 55 ℃ 72 ℃ 循环仪 预变性 94oC5’ PCR技术的基本过程

加样孔 PCR DNA Marker PT-PCR 电泳图谱

基 因 检 测

对一个基因或一段DNA片段进行检测鉴定是分子医学技术中最常用到的手段。包括电泳检测、序列分析、分光光度分析等方法。

加样孔 电泳条带 DNA分子的电泳检测

凝胶浓度与DNA片段大小 电压、电流与分辨率 电泳缓冲液、上样缓冲液 电泳的时间与环境温度 凝胶板的制备

法国VL凝胶成像系统

共轭双键：对260nm波长紫外光有较强吸收。 消光系数 波长 220 240 260 280 300 核酸定量和纯度分析

BECKMAN DU 800 核酸蛋白检测仪

DNA序列检测

基因重组与基因工程

基因重组技术作为分子医学中最重要、最基本的技术之一，是许多分子医学实验实施的基础，在基因诊断、治疗和预防中具有举足轻重的意义。

现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）在1960年以敏锐的科学预见力提出一个大胆的设想：是否可以创造出一种人工方法，把外界的遗传基因引入动物体内，以达到改变遗传性状和治疗某些疾病的需要呢？1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。

1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。

科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。 1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。

基因工程问世后的短短30年间，不仅催生了一个又一个基因工程的新成果，也催生了一个源于DNA研究的新兴产业，导致众多的生命科学高技术企业应运而生。到2001年年初，美国生物技术公司已有1400家，而这一数字还不包括为数更多的相关技术公司和传统制药公司，2000年底美国生物技术产业的收入达到250亿美元。可以毫不夸张地说，基因工程对生物、医药和农业等领域都产生了革命性的影响，它对人们生活影响的深度和广度早已超出了人们的想象。

淡绿、橘黄、浅红、金黄……用这些天然彩色蚕茧丝无需染色而织成色彩斑斓的绸缎，兼具华美外观和环保内质。通过基因重组法选育高产彩色茧蚕品种获成功。

玫瑰的栽培历史可以追溯到5000年前，但通过色素呈现出蓝色的玫瑰却从来没有过。从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素的基因，然后注入到玫瑰中，并成功地让翠雀花素单独显色。　　

目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 总体技术路线

分:

切: “分子手术刀 ” 限制性内切酶 限制性 酶活性 缓冲液 甲基化 底物性状

“分子剪刀”的发现者

接: “分子针线” DNA 连接酶

转:

筛: 基因载体 宿主细胞 克隆位点

基因表达

SS蛋白 + SS基因 重组体 大肠杆菌

1 E.coli表达体系 优势： 一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达

不足之处： 1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。 2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。 3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。

2 目的基因高效表达 三个因素： 强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象

3目的基因表达产物的检测 1）蛋白质的PAGE 对照 样品 Marker

2）表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达

4目的蛋白的分离纯化 分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体 目的蛋白

安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC）

基因探测

核酸杂交：探测基因所依据的最基本的理论就是核酸碱基互补原则，最常用的方法就是核酸分子杂交，它应用一段与目标基因碱基互补的核酸作为探针去探测待测样品 核酸探针：探针是一段人工合成的碱基序列，连接上一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用探针到基因混合物中识别特定基因 核酸标记： 同位素标记 非同位素标记

DNA聚合酶Ⅰ DNA -32P-dNTP 缺口平移

5‘ 3’聚合酶 5‘ 3’外切酶 DNA聚合酶Ⅰ 5’ 5’ 5’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA-----3’ 3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-------5’

-32P-dNTP 5’-CCCCAACCC…… 3’-GTTGGG…… 末端标记物 5’-CCCCAACCC…… 3’-GGGGTTGGG……

基因芯片（Genechip） 基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列。它高度集成成千上万的网格状密集排列的核酸分子（也叫分子探针）。 基因芯片能快速破译人类基因组和检测基因突变，目前，该技术主要应用于基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。它的出现给分子生物学、细胞生物学及医学领域带来新的革命，成为后基因时代最重要的基因功能分析技术之一。

应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达

DNA微点阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、以及新型癌症的分类。

基因转移

转基因生物是指用实验方法导入的外源基因在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。

囊性纤维变性是一种遗传病，患者体内会产生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的内部通道，大约有一半的患者活不过31岁。英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊奶中含有能够治疗囊性纤维变性的人体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾向德国一家药厂出售一头这样的转基因羊，获得50万英镑。                                                                                                                                                                      

“克隆”和“转基因”之间最大的不同是前者纹丝不动地保留了原来的遗传性状，而后者则改变了原来的遗传性状。“克隆”是无性繁殖，克隆动物是不经过生殖细胞而直接由体细胞获得的新个体；而转基因动物和普通动物的区别只在于在受精卵或胚胎干细胞中转入了另外的基因。 　 如果能将克隆技术和转基因技术结合起来的话，也许可以在短时间内就得到许多一模一样的拥有优良性状的转基因动物。也就是说，转基因动物将不再是单个生产，而是批量生产。这对于制药或器官移植等领域来说是一个很有潜力的发展方向

                                                                                                                                                                     克隆羊“多利”

基因测序与信息技术

基因测序是确定DNA双股链上每个独立结构单元或碱基的确切顺序的过程。测序经常被称为“破译”，因为其结果就像解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行4种字母的序列。这些字母表示4种不同的碱基，分别用它们的首字母A、T、C、G表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生命指令。 生物信息学((bioinformation) 是一门伴随着基因组研究而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理以及对这些数据的应用。

解读生命的“天书”---人类基因组计划  基因组，指的是生物体内的所有DNA，包括它的基因。人类基因组计划要测定的是人体23对染色体中的所有DNA的序列，它由31.647亿个碱基对组成，共有3万至3.5万个基因。换句话说，生命天书是由30多亿个字写成的，如果将这30多亿字排版到一张报纸上，那么大约需要20万页纸才能排完这部巨著。 由此可以想见，读取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。                                                                         

美国生物化学家穆利斯、1993年因创建PCR技术获诺贝尔化学奖。                                                                                                                                           美国生物化学家穆利斯、1993年因创建PCR技术获诺贝尔化学奖。 英国著名化学家桑格。他因测定出胰岛素的氨基酸排列顺序获1958年诺贝尔化学奖，又因发明测定DNA序列的方法（即桑格法）获1980年诺贝尔化学奖 美国分子生物学家W·吉尔伯特因发明出另一种测定DNA序列的方法，与桑格分享1980年诺贝尔化学奖。

根据桑格法开发的DNA自动定序机使一周（24小时运转）解读100万甚至几百万个碱基成为可能。它为“人类基因组计划”立下了汗马功劳                                                                                                                     根据桑格法开发的DNA自动定序机使一周（24小时运转）解读100万甚至几百万个碱基成为可能。它为“人类基因组计划”立下了汗马功劳

“人类基因组计划”的主要任务包括： 找出人类DNA上的所有基因（当时估计约10万个，后来证实只有3-3.5万个），确定30亿个碱基对的排列顺序； 建立相应的数据库，进行数据分析，并分析此计划可能带来的人种、伦理及社会问题； 对一些动物的遗传组成进行研究，包括大肠杆菌，果蝇和小白鼠等。

　 DNA双螺旋结构体现着一种与和谐的大自然之美交相辉映的科学之美。DNA是螺旋状的，生命科学的探索之路也是螺旋的。人体自身和大千世界还有数不清的未解之谜，正等待着人们进行探索。让我们续写和创造永无止境的螺旋之美。