第24章 生物氧化—— 电子传递和氧化磷酸化作用

第24章 生物氧化——电子传递和氧化磷酸化作用 主要内容 概述 电子传递 氧化磷酸化

一、概述 有机分子在细胞内氧化分解成二氧化碳和水，并释放出能量形成ATP的过程，笼统称为生物氧化。 生物氧化特点： 概述 在体温下进行，通过酶的催化作用使有机分子发生一系列的化学变化，同时逐步氧化释放能量。 氧化过程中产生的能量一般都贮存于一些特殊的化合物中，主要是ATP中。

概述 The discovery in 1948 by Eugene Kennedy and Albert Lehninger that mitochondria are the site of oxidative phosphorylation in eukaryotes marked the beginning of the modern phase of studies in biological energy transductions.

电子传递 二、电子传递 （一）电子传递过程 电子传递过程包括电子从还原型辅酶上通过 一系列按照电子亲和力递增顺序排列的电子载体所构成的电子传递链传递到氧的过程。 需氧细胞内糖、脂肪、氨基酸等通过各自的分解途径，所形成的还原型辅酶，包括NADH和FADH2通过电子传递途径被重新氧化。还原型辅酶上的氢原子以质子形式脱下， 其电子沿着一系列的电子载体转移，最后转移到分子氧。质子和离子型氧结合成水。在电子传递过程中释放出的大量自由能则使ADP磷酸化成ATP。

电子传递 （二）电子传递链 电子从NADH到O2的传递所经过的途径形象地被称为电子链，也称呼吸链。由一系列的递氢体(hydrogen transfer)和递电子体(eletron transfer)按一定的顺序排列所组成的连续反应体系，它将代谢物脱下的成对氢原子交给氧生成水，同时有ATP生成。

电子传递

电子传递 （三）电子载体： 呼吸链电子载体主要有：NAD+、黄素蛋白、辅酶Q 、铁硫蛋白、铜原子、细胞色素等。

电子传递 1、NAD+ 即烟酰胺嘌呤二核苷酸，是体内很多脱氢酶的辅酶，连接三羧酸循环和呼吸链。 （NAD＋：R＝H，NADP＋：R＝－PO3H2）

电子传递

电子传递 NAD+-linked dehydrogenases remove two hydrogen atoms from their substrates. One of these is transferred as a hydride ion (:H-) to NAD+; the other is released as H+ in the medium

电子传递 2、黄素蛋白： 含FMN或FAD的蛋白质，每个FMN或FAD可接受2个电子2个质子。呼吸链上具有FMN为辅基的NADH脱氢酶，以FAD为辅基的琥珀酸脱氢酶。

电子传递 3、辅酶Q： 是脂溶性小分子量的醌类化合物，通过氧化和还原传递电子。有3种氧化还原形式即氧化型醌Q，还原型氢醌（QH2）和介于两者之者的自由基半醌（QH）。

电子传递

电子传递 4、铁硫蛋白： 在其分子结构中每个铁原子和4个硫原子结合，通过Fe2+、Fe3+互变进行电子传递，有FeS、2Fe-2S和4Fe-4S三种类型

电子传递

电子传递 All iron-sulfur proteins participate in one-electron transfers in which one iron atom of the iron-sulfur cluster is oxidized or reduced. At least eight Fe-S proteins function in mitochondrial electron transfer. The reduction potential of Fe-S proteins varies from -0.65 V to +0.45 V, depending on the microenvironment of the iron within the protein.

电子传递 5、铜原子： 位于线粒体内膜的细胞色素氧化酶上，形成类似于铁硫蛋白的结构，通过Cu2+、Cu1+的变化传递电子。

电子传递 6、细胞色素： 分子中含有血红素铁，以共价形式与蛋白结合，通过Fe3+、Fe2+形式变化传递电子，呼吸链中有5类，即：细胞色素a、a3、b、c、c1，其中a、a3含有铜原子。

电子传递 Typical visible absorption spectra of cytochromes

电子传递 （四）呼吸链的复合体

电子传递 （四）呼吸链的复合体 1、复合体I

电子传递 复合体I中依次进行的反应 1、在NADH脱氢酶的作用下，NADH将一个氢负离子转移给FMN，形成FMNH2。 2、FMNH2经两步将2H传给辅酶Q。辅酶Q一次接受一个电子，经过半醌阴离子中间物（Q·-），最后达到充分还原态泛醌醇（QH2）。 3、每从NADH转移一对电子给Q，将有4个质子被转移到膜间隙。

电子传递

电子传递 2、复合体II（琥珀酸-Q还原酶） 复合体II至少由4条肽链组成，含有一个FAD，3个铁硫蛋白，其作用是催化电子从琥珀酸转至辅酶Q，但不转移质子。电子传递的方向为：琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。

电子传递 3、复合体III（细胞色素还原酶）

电子传递 二个QH2参与电子传递过程，使二个细胞色素C还原，经过全过程又产生了一个QH2。这样使得携带二个电子的载体QH2经过细胞色素还原酶后转交给带一个电子的细胞色素C。 这有利于电子的有效利用。

电子传递 4、复合体IV（细胞色素氧化酶） 细胞色素氧化酶接受和传递电子的顺序是： 细胞色素C CuA 血红素a血红素a3  CuB，最后交给分子氧形成水。

电子传递

电子传递 A model for the mechanism of O2 reduction by cytochrome oxidase

电子传递 （五）两条主要的呼吸链 复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组成主要的呼吸链，催化NADH的脱氢氧化，复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组成另一条呼吸链，催化琥珀酸的脱氢氧化

电子传递 （六）电子传递的抑制剂

氧化磷酸化 三、氧化磷酸化

氧化磷酸化

三、氧化磷酸化 氧化磷酸化 1、能量偶联的假说 电子在传递链中究竟怎样从一个中间载体到另一个中间载体的过程中促使ADP磷酸化？ 三种假说：化学偶联假说、结构偶联假说、化学渗透假说。

氧化磷酸化 化学渗透假说： 电子传递链像一个质子泵，电子传递过程中所释放的能量，可促使质子由线粒体基质移位到线粒体内膜外膜间空间形成质子电化学梯度，即线粒体外侧的H+浓度大于内侧并蕴藏了能量。当电子传递被泵出的质子，在H+浓度梯度的驱动下通过FoF1ATP酶中的特异的H+通道或“孔道”流动返回线粒体基质时，则由于H+流动返回所释放的自由能提供FoF1ATP酶催化ADP与Pi偶联生成ATP。

氧化磷酸化 此假说主要包括以下几点内容： 偶联需要完整的线粒体内膜。膜对带电的溶剂是不通透的，否则质子浓度梯度将消 失，离子代谢物通过特殊的转运体跨过膜。 通过电子传递链的电子传递产生质子浓度梯度，使得线粒体内膜外侧（膜间隙）的H＋浓度升高。 位于线粒体内膜上的ATP合成酶在跨膜的质子转移驱动反应中催化ADP磷酸化

氧化磷酸化

氧化磷酸化 2、质子梯度的形成 电子传递使复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ推动H 跨过线粒体内膜到 线粒体的间隙，线粒体间隙与细胞溶胶相接触。H 跨膜流动的 结果造成线粒体内膜内部基质的 H 浓度低于间隙。线粒体基质形成负电势，而间隙形成正电势，这样产生的电化学梯度即电动势称为质子动势或质子动力。其中蕴藏着自由能即是ATP合成的动力。

氧化磷酸化 质子转移的机制有两种假设： （1） 氧化—还原回路机制 该机制由Mitchell 提出。他认为线粒体内膜呼吸链的各个氧化—还原中心即FMN、CoQ、细胞色素以及铁—硫聚簇的排列可能既能执行电子的转移，又能转移基质的质子。前一个被还原的氧化—还原中心被后一个氧化—还原中心再氧化， 同时相伴而产生的是质子的转移，包括质子由基质泵出和在线粒体内膜外的质子回流到基质一边。

氧化磷酸化 （2） 质子泵机制 这个机制的内容是，电子传递导致复合体的构像变化。质子转移是氨基酸侧链PK值变化产生影响的结果。构像变化造成氨基酸侧链PK值的改变，结果发挥质子泵作用的侧链暴露在外并交替地暴露在线粒体内膜的内侧或外侧，从而是质子发生移位。这种系统即认为是质子泵的机制

1960年，E.Racker的氧化磷酸化的重组实验： 3、ATP合酶的结构和作用机理 1960年，E.Racker的氧化磷酸化的重组实验： 超声波 胰蛋白酶 或尿素 重组 亚线粒体囊泡 有电子传递能力 但不能使ADP磷酸化 具备氧化磷酸化能力

氧化磷酸化 3、ATP合酶的结构和作用机理 ATP合酶（ATP synthetase），分子量500KD。分为球形的F1（头部）和嵌入膜中的Fo（基部），它可以利用质子动力势合成ATP，也可以水解ATP，转运质子。

氧化磷酸化 F1由5种多肽组成α3β3γδε复合体，具有三个ATP合成的催化位点（每个β亚基具有一个）。α和β单位交替排列，状如桔瓣。γ贯穿αβ复合体（相当于发电机的转子），并与F0接触，ε帮助γ与F0结合。δ与F0的两个b亚基形成固定αβ复合体的结构（相当于发电机的定子）。 F0由三种多肽组成ab2c12复合体，嵌入内膜，12个c亚基组成一个环形结构，具有质子通道，可使质子由膜间隙流回基质。

氧化磷酸化 ATP的合成机制——构象耦联假说 ATP酶利用质子动力势，产生构象的改变，改变与底物的亲和力，催化ADP与Pi形成ATP。 F1具有三个催化位点，但在特定的时间，三个催化位点的构象不同、因而与核苷酸的亲和力不同。在L构象（loose），ADP、 Pi与酶疏松结合在一起；在T（tight)构象底物与酶紧密结合在一起，在这种情况下可将两者加合在一 起;在O(open)构象ATP与酶的亲和力很低，被释放出去。

氧化磷酸化 ATP的合成机制——构象耦联假说 质子通过F0时，引起c亚基构成的环旋转，从而带动γ亚基旋转，由于γ亚基的端部是高度不对称的，它的旋转引起β亚基3个催化位点构象的周期性变化（L、T、O），不断将ADP和Pi加合在一起，形成ATP。

氧化磷酸化 Noji H et al. Nature, 1997,386:299-302

氧化磷酸化 P/O比（每对电子沿传递链转移所产生的ATP数）取决于跨膜转运的质子数。每分子ATP的合成大约需要4个质子的转移，NADH沿传递链传递伴随10个质子的跨膜转运，因此产生2.5ATP，FADH2沿传递链传递只伴随6个质子的跨膜转运，故产生1.5ATP。

氧化磷酸化 4、氧化磷酸化的解偶联和抑制 （1）解偶联剂(uncoupler)　解偶联剂使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂作用的本质是增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+的跨膜梯度，因而无ATP生成，解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化，解偶联剂的作用使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织线粒体中有独特的解偶联蛋白，使氧化磷酸化处于解偶联状态，这对于维持动物的体温十分重要。 常用的解偶联剂有2，4-二硝基酚(dinitrophenol,DNP)，羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)，双香豆素(dicoumarin)等，过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。

氧化磷酸化 4、氧化磷酸化的解偶联和抑制 （2）磷酸化抑制剂 与F0结合结合，阻断H+通道，从而抑制ATP合成。如：寡霉素（oligomycin）、二环己基碳化二亚胺(dicyclohexyl carbodiimide，DCC)

5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制 氧化磷酸化 5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制 （1）甘油磷酸穿梭机制 首先，在胞液甘油-3-磷酸脱氢酶催化下，NADH使磷酸二羟丙酮还原生成甘油-3-磷酸 然后，甘油-3-磷酸被跨膜的甘油-3-磷酸脱氢酶复合物转换回二羟丙酮磷酸。 在转换过程中，两个电子被转移到跨膜酶的FAD辅基上生成FADH2。FADH2将两个电子转给可移动的电子载体Q，然后再转给泛醌-细胞色素c氧化还原酶（复合物III）。 胞液中的NADH通过这一途径转换成QH2后氧化所产生的能量（1.5个ATP）比线粒体内NADH氧化的能量（2.5个ATP）少。

氧化磷酸化 5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制

5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制 氧化磷酸化 5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制 （2）苹果酸-天冬氨酸穿梭机制 首先，在苹果酸脱氢酶的催化下，胞液NADH将草酰乙酸还原为苹果酸。 其次，苹果酸经二羧酸转位酶进入线粒体基质。 在基质中，线粒体苹果酸脱氢酶催化苹果酸重新氧化为草酰乙酸，使线粒体内的NAD＋还原为NADH，经呼吸链氧化。 草酰乙酸在线粒体天冬氨酸转氨酶的催化下，与谷氨酸反应生成a-酮戊二酸和天冬氨酸。 a-酮戊二酸经二羧酸转位酶运出线粒体。

5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制 氧化磷酸化 5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制 （2）苹果酸-天冬氨酸穿梭机制 天冬氨酸经谷氨酸-天冬氨酸转位酶与谷氨酸交换运出线粒体。 在胞液中，天冬氨酸和a-酮戊二酸在天冬氨酸转氨酶的作用下生成谷氨酸和草酰乙酸，谷氨酸在与天冬氨酸的交换中重新进入线粒体，而草酰乙酸与胞液中的另一分子NADH反应，重复上述循环。 胞液中的NADH经苹果酸-天冬氨酸穿梭途径可以转换为线粒体中的NADH，再经电子传递和氧化磷酸化过程，所以胞液中的一分子NADH也可以生成2.5分子ATP。

氧化磷酸化 5、细胞溶胶内NADH的再氧化——穿梭机制

氧化磷酸化 6、葡萄糖彻底氧化的总结算

Questions: 有功能的电子转移系统可以用纯化的电子传递链的组分和膜颗粒重新构成。根据下面的每套组分确定最后的电子受体。假定O2存在。 ①NADH、CoQ、复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ； ②NADH、CoQ、细胞色素c、复合物Ⅱ和Ⅲ； ③琥珀酸、CoQ、细胞色素c、复合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ； ④琥珀酸、CoQ、细胞色素c、复合物Ⅱ和Ⅲ。

Questions: 把一种广泛使用的处方止痛药Demerol（地美罗）加入到处在呼吸状态的线粒体悬浮液中，[NADH]/[NAD＋]和[CoQ]/[CoQH2]的比例增高。哪个部位电子传递复合物被Demerol抑制？

7 Questions: 大多数脱氢酶对NAD+是专一的，从不同底物上脱下的电子大多数可以集中到同一分子NAD+上，然后以还原型的形式进入呼吸链。但是，线粒体外的NADH必须穿过线粒体内膜才能进入呼吸链被氧化。如果把在C-4用3H标记的NADH加入到含有线粒体和全部胞液酶的鼠肝制剂中，放射性很快出现在线粒体基质中。但是，如果加入在C-7用14C标记的NADH，放射性不会出现在线粒体基质中。关于线粒体外的NADH通过呼吸链被氧化，上述这些观察告诉我们什么样的结论?