关于坏死性肠炎的研究分析 及解决方案 金百合生物.

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关于坏死性肠炎的研究分析 及解决方案 金百合生物

1 2 3 4 坏死性肠炎病理学 与流行病学 导致坏死性肠炎 的饲料因素 球虫及免疫应激所 致的坏死性肠炎 毒素所致的坏死性 肠炎-及解决方案

写在前面的话 1、消费者对于减少饲料中添加促生长抗生素的需求,家禽业公司正在逐步减少或消除饲料中的预防用抗生素。 2、现在的饲料配方不仅要考虑家禽的营养指标,同时肠道健康的一些问题也变得越来越重要。 3、当饲料中不再添加促生长抗生素后,如何增强肠道健康显得尤为重要,家禽公司也面临许多肠道病原的挑战。 4、近年来,坏死性肠炎作为一种较严重的疾病又再度出现。 其中,抗生素在养禽业中使用的减少,是导致坏死性肠炎高发的主要原因。 5、由坏死性肠炎导致的日死淘率,最高可在1%,这给养禽业造成了巨大的经济损失。 6、较高的经济损失,不仅来源于坏死性肠炎导致的死淘率,还在于家禽较差的生产表现,及坏死性肠炎引起的亚临床症状。 7、感染坏死性肠炎幸存下来的家禽,由于肠道粘膜受到破坏,所以,消化吸收能力变差,影响经济效益! 写在前面的话

概述 坏死性肠炎(NE)是家禽中的一种肠毒血症,严重影响家禽业的经济效益。具统计全球每年因坏死性肠炎导致的经济损失有20亿美元[1,2]。坏死性肠炎导致的生产性能下降,不仅是家禽生长速度和饲料转化率的下降,还在于坏死性肠炎引起的家禽肝炎症状,增加了食品企业的社会舆论风险[3,4]。 在过去,抗生素一直用于控制规模化养殖中的坏死性肠炎[5,6]。然而,现在坏死性肠炎又重新作为一种影响较大的疾病出现,可能是由于政府出台一系列禁止和限制促生长抗生素在家禽饲料中的添加所致。另外,消费者也对家禽业生产影响很大,终端消费者对于抗生素的抵制,也是近些年来坏死性肠炎高发的重要原因。本文就讨论当下坏死性肠炎的最新进展和在防治措施上的改变。

病理学和流行病学 产气荚膜梭菌分布广泛,可以在动物肠道和环境中分离得到,比如,土壤,水和食物中。 产气荚膜梭菌(A型和C型)是引起NE的病原体。产气荚膜梭菌属于革兰氏阳性菌,杆状,厌氧有荚膜,可以在动物及人引起广泛的疾病。 产气荚膜梭菌会引起乳糖的剧烈发酵,同时还可以使葡萄糖,果糖,半乳糖,肌醇,麦芽糖,甘露糖发酵。 发酵产物包括醋酸,丁酸。产气荚膜梭菌可以在一个较广的PH范围内生存,可以从5.5到8.5,其最适PH是PH6到PH7。根据细菌产生外毒素的种类差别,可将产气荚膜梭菌分成a、b、c、d、e5个型。 产气荚膜梭菌分布广泛,可以在动物肠道和环境中分离得到,比如,土壤,水和食物中。 该菌最早在肠道中定植可能发生在家禽孵化出壳时。有报道称,在鸡回肠食糜中的产气荚膜梭菌达到105 cfu/g时就会引起坏死性肠炎[12]。Craven等人曾经在破碎的蛋壳上,鸡羽毛上,及在孵化厂收到的废纸中分离出产气荚膜梭菌。假定产气荚膜梭菌是在鸡肠道中自然存在的,那么疾病的发生可能取决于其他诱因,这还有待与进一步研究。

病理学和流行病学 尽管坏死性肠炎在2周到6个月大的鸡均易感,但是在不同品种和饲养条件下,其发病率不同。 1、地面散养的肉鸡,大部分的坏死性肠炎主要发生在第二周和第五周[4,5,14]。 2、与此相反,养禽公司规模化饲养的肉鸡,据报道坏死性肠炎主要发生在3到6个月[4]。 3、由坏死性肠炎导致的死亡率一般在2%到10%左右;有报道称最高的死亡率可达到50%。 产气荚膜梭菌是动物肠道内的常在菌株,该菌单独存在并不会引起坏死性肠炎。因此,致病诱因会导致产气荚膜梭菌过度繁殖,进而引起坏死性肠炎。我们发现了几个诱因,其中包括,饲料因素,免疫和应激,肠道生理变化及球虫病。

1 2 3 4 过渡页 坏死性肠炎病理学 与流行病学 导致坏死性肠炎 的饲料因素 球虫及免疫应激所 致的坏死性肠炎 毒素所致的坏死性 肠炎-及解决方案

肠道的生态系统对饲料中的成分非常敏感。特定的营养物质的不同含量水平会影响到肠道微生物菌群,并影响到鸡的生产性能及对疾病的易感程度。几个不同的饲料成分可能就会使产气荚膜梭菌快速增殖,并导致坏死性肠炎的发生。 一、 抗营养因子-NSP 三、蛋白来源 二、 日粮蛋白质水平 四、矿物质含量 饲料因素

饲料因素 配方中添加的谷物(大麦、燕麦、黑麦、小麦)含有很多难消化的,可溶性的抗营养因子(NSP) 一、抗营养因子NSP 抗营养因子 NSP 蛋白来源 NSP在鸡的肠道内会增加消化物的粘性,影响肉鸡的生产性能。NSP影响生产成绩,可能与其降低营养物质的消化吸收有关,比如,氨基酸,脂肪和胆固醇,并且还会影响到糖的吸收[20-22]。 这些营养物质会在肠道内被微生物利用,可能会改变肠道内菌群类型和菌群平衡状态[22,23]。Jia等称,日粮中高水平的NSP使鸡肠道中的消化物变得更加粘稠。NSP引起肠道消化物粘稠,主要是由于NSP刺激肠道粘膜分泌粘液增加,并增加了复合多糖与水结合的能力。高粘度的消化物会阻止食物与消化酶的接触,影响食物的消化吸收。结果导致未被充分消化吸收的营养物质进入肠道后端被微生物利用。导致产气荚膜梭菌快速增殖超过其他菌群[23]。 饲料因素 日粮蛋白质水平 矿物质水平

饲料因素 二、日粮蛋白质水平 高蛋白日粮会导致肠胃食糜高蛋白水平,为微生物生长提供了很好的基质[14]。 日粮蛋白质水平 抗营养因子 NSP 蛋白质在小肠中被消化成含氮(氨基酸和多肽)混合物,不仅会提高肠道内PH还会引起肠道致病菌的繁殖,包括产气荚膜梭菌[8,15]。 饲料因素 蛋白来源 矿物质水平

饲料因素 蛋白质来源要比蛋白质水平对NE的发生影响更大 三、蛋白来源 蛋白来源 抗营养因子 NSP 日粮蛋白质水平 矿物质水平 Timber等认为动物蛋白含有更高水平的难消化的蛋白质进入盲肠,给产气荚膜梭菌繁殖提供了基质。 另一种可能性就是,日粮中氨基酸不平衡(尤其是蛋氨酸和甘氨酸)导致盲肠中产气荚膜酸菌繁殖,出现NE症状[5,28]。 然而,为什么动物蛋白日粮更容易导致NE的发生,现在还不清楚。 饲料因素 日粮蛋白质水平 矿物质水平

饲料因素 四、矿物质水平 矿物质在日粮中的水平也会影响鸡群NE的发生 矿物质水平 抗营养因子 NSP 日粮蛋白质水平 蛋白来源 Zn是第一个与NE有关的矿物质,Zn参与α-毒素的激活。产气荚膜梭菌产生的α-毒素依靠性Zn水解脂质膜[15,29,30]。 日粮中Ca的水平也与NE的发病机制有关,但是Ca是如何有利于产气荚膜梭菌的机制还不清楚。有可能超额的Ca会使肠道PH升高[31,32],产气荚膜梭菌比在自然环境中生长的更快。Paiva等[34]报道称,由NE导致的死亡率,在日粮中添加0.9%的Ca要比添加0.6%的高。但是,在该研究中并未观察两种Ca添加量导致的胃肠PH的变化,有可能Ca是激活α-毒素和NetB毒素需要的,但是该机制还需要进一步研究证实。 抗营养因子 NSP 饲料因素 日粮蛋白质水平 蛋白来源

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球虫病及球虫免疫 球虫病是研究发现的最容易导致NE的因素 1、鸡球虫病通常由2种或以上的艾美尔球虫引起,艾美尔球虫包括:柔嫩艾美尔球虫,巨型艾美尔球虫,堆型艾美尔球虫,毒害艾美尔球虫。 2、球虫卵囊在养殖场环境中无处不在,导致该寄生虫在环境中不断循环和生存。艾美尔球虫的循环生活史比较复杂,包括在宿主体内和体外的各个阶段。球虫对肠道的损伤,使肠道内充满了血浆蛋白,氨基酸和各种生长因子,维生素等为梭菌生长提供了很好的基质[3,5,14]。 3、另外胃肠道的破坏,导致食物消化能力降低,可能会增加产气荚膜梭菌利用肠道中营养物质的几率。还有就是,球虫会引起局部T细胞的炎症反应,使肠道粘液分泌增加。最终有利于产气荚膜酸菌的生长。 球虫病及球虫免疫

球虫生活史

免疫状态和应激 免疫抑制的病原 管理因素 艾美尔球虫 传染性法氏囊病 传染性贫血病毒 马立克氏病毒 换料 垫料处理 1、免疫抑制会使NE发生率增高,因为引起免疫抑制的各种因素,会改变肠道内环境和肠道菌群类型。引起免疫抑制的病原被证实会增加鸡患NE的几率在一针对NE的模型研究当中,McReynolds等报道称,感染传染性法氏囊病毒的鸡群往往会继发感染产气荚膜梭菌。应激可能是上面提到的引起免疫抑制的因素。 2、环境,管理因素,也会引起免疫抑制,导致继发感染NE。 免疫抑制的病原 艾美尔球虫 传染性法氏囊病 传染性贫血病毒 马立克氏病毒 管理因素 换料 垫料处理 饲养密度 免疫程序 冷、热应激

肠道病理生理学 食物通过时间延长 微生物利用营养物质 产气荚膜梭菌快速繁殖 成长为优势菌群 肠道蠕动 变慢 当肠道内环境不利于产气荚膜梭菌时,就不会导致发病。然而当有些肠道生理环境下会导致NE的发生,比如,肠道蠕动变慢,肠道内PH的改变,肠道粘膜遭到破坏[5,7,16]。当肠道蠕动减慢时,食物通过肠道的时间延长,这增加了肠道微生物利用肠道内营养的机会。导致产气荚膜梭菌快速增殖成为优势菌群。 另外,消化道内食物运动减慢,也就意味着肠道内微生物受到食糜冲刷的几率下降,这就增加了病原微生物的大量增殖,最终导致疾病的发生。

肠道的酸碱度也会影响到NE的发生。 高PH肠道环境更有利于鸡群发生NE,产气荚膜梭菌在酸性环境下会受到抑制[36]。肠道粘膜的损坏是导致NE发生的另一个因素。 以上几种综合性因素促使鸡群成为NE的易感动物。比如,肠道PH的改变,肠道中过量的营养物质,肠道完整性遭到破坏。

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毒素所致的坏死性肠炎 1 1 A型包含产生α毒素的毒株 产气荚膜梭菌是一种胞外病原菌,因此其毒力大小取决于产生毒素的能力。产气荚膜梭菌能够产生多大17种有毒的或潜在的毒素。根据产气荚膜梭菌产生的4种主要的毒素: α, β, ε,将其细分为5个型(A,B,C,D,E)。 只有A型和C型产气荚膜梭菌与NE有关,目前研究表示,α, β毒素与NE有关。 2 B型是产生 α, β, ε,的毒株 4 2 3 C型是产生 α, β毒素的毒株 4 D型是产生 α, ε毒素的毒株 3 5 E型是产生α,ι毒素的毒株

α毒素 一、α毒素是一种锌依赖型磷脂水解酶C,由磷脂水解酶C基因表达产生。 1、α毒素由两个独特的位端: N端(247位点)携带磷脂水解作用的活性位点,C端(123位点)携带亲脂位点[29,39]。 2、α毒素需要锌作为水解作用的底物 3、钙对于α毒素与脂质膜的结合很重要[30,39,40]。 高钙离子浓度是发挥最佳的酶解作用的生理学基质。 4、Α 毒素具有细胞毒性,能导致红细胞,吞噬细胞,成纤维细胞,血小板,白细胞,内皮细胞和肌细胞溶解

α毒素 二、α毒素的水解磷脂作用,导致体内细胞细胞膜解体。 1、细胞膜基质主要由卵磷脂和鞘磷脂组成,也是肠胃上皮细胞细胞膜的主要组成部分2、细胞膜水解的机理比较复杂,包括钙依赖型磷脂的识别,钙离子一部分通过α毒素的酸性氨基酸位点参与调节,一部分通过细胞膜的磷酸基团参与调节。 3、细胞膜磷脂的水解导致甘油二酯的形成,然后就是蛋白激酶的激活,紧接着引起花生四烯酸的大量外泄。 4、花生四烯酸外泄的结果就是大量炎症反应因子产生(白细胞三烯,凝血因子,前列腺素),这些会引起血管收缩,血小板集聚,心肌功能障碍,导致急性死亡。 参考下一页示意图

α毒素的水解磷脂作用,导致体内细胞细胞膜解体 钙离子通过α毒素参与调节 部分通过磷酸基团参与调节 甘油二酯生成 蛋白激酶激活 花生四烯酸 大量炎症反应因子产生 α毒素的水解磷脂作用,导致体内细胞细胞膜解体

α毒素 α毒素 α毒素已经被证实是引起禽NE的主要毒素 (Al-Sheikh-ly and Truscott [42]能够通过给鸡灌服无菌 毒素成功复制除了NE病例) 另一种表述就是: 1、在发生NE的鸡肠道中分离的产气荚膜梭菌,要比在无NE的鸡肠道中分离的产气荚膜梭菌产生更多的α毒素。 2、关于肉鸡对NE免疫反应的研究中也表示,NE的发病机制中α 毒素是一种重要毒力因子。 发生NE的鸡体内针对α 毒素的抗体显著低于健康鸡。 3、健康鸡群体内的抗毒素水平高于NE鸡群,这说明这些抗毒素可能会保护鸡群不受NE的影响。 α毒素

α毒素 尽管这些研究都表明α 毒素是导致NE的主要毒力因子,由于这些早期的研究是使用未被提纯的上清液作为病原攻毒,所以这些结论可能会被质疑。这些研究的结论是α 毒素作为一种蛋白质存在与未被提纯的上清液中,但是,他们并未考虑到上清中还会有其他的可能与NE有关类似蛋白存在。其中α 毒素不是引起NE最值得信服的证据来源于Keyburn et al. 使用一种在NE病变鸡身上分离的α 毒素阴性突变产气荚膜梭菌感染肉鸡,仍然可以在肉鸡身上复制出NE。其他关于NE发病机制的研究也表明,α毒素不是主要的导致NE的毒力因子。发生NE的重要标志之一是粒细胞会从组织中迁移到肠腔中[47]。这种炎症反应明显区别于由α 毒素引起的白细胞停滞和炎症反应抑制[48]。这表明NE导致的损伤不只是由α毒素引起。 α毒素

NetB 毒素 1、NetB是另一种与肉鸡NE有关的毒素,是一种可在细胞膜上凿孔导致细胞解体的毒素,该毒素相似于产气荚膜梭菌的β毒素(38%相似度),产气荚膜梭菌的gamma毒素(40%相似度),金黄色葡萄球菌的α溶血素(30%相似度),金黄色葡萄球菌的的gamma毒素(23%相似度)。 2、NetB在细胞膜上产生的孔径最少在1.6nm,导致离子流入细胞(Ca,Na, Cl等等),细胞渗透压发生改变而崩解[49,50]。

NetB 毒素 1、由NetB产生的孔洞带有负电荷,这也就解释了为什么NetB孔洞有阳离子选择特性[50,51]。

NetB 毒素 1、由NetB产生的孔洞带有负电荷,这也就解释了为什么NetB孔洞有阳离子选择特性[50,51]。

netB可能还会引起一种特殊类型的程序化细胞死亡 另外,netB使Ca的流入改变细胞渗透压导致细胞崩解,可能还会引起一种特殊类型的程序化细胞死亡。Kennedy et al.报道称,由坏疽性梭菌的α 毒素产生的孔洞,引起Ca在细胞内浓度增加,他们惊奇的发现,Ca离子的内流不会引起细胞的凋亡。相反,Ca离子内流引起了一系列的程序化坏死,Ca酶的激活,溶酶体释放大量的组织溶解酶。另外,还发现线粒体内活性氧异常增加,ATP水平急剧下降[53]。这些发现都证明了,由于孔洞NetB毒素造成的细胞死亡与程序化细胞坏死有关。

NetB 毒素 有强有力的证据证明,netB毒素是NE发展的一种重要的毒力因子。 1、最初在NE鸡身上分离到的产气荚膜梭菌,大部分(77%)是netB毒素阳性[49,52]。 2、另外,分离到的不能引起NE的产气荚膜梭菌,大部分(91.2%)是netB毒素基因阴性。Keyburn et al报道,敲除netB毒素基因后的产气荚膜梭菌不会引起NE。尽管,netB毒素与NE的发生有明显的关系,但是,也不是分离到的引起NE的所有菌株都是netB毒素阳性。可能还有其他的毒力因子与NE的发生有关。在健康的鸡体内也分离到了netB毒素阳性菌株,说明netB毒素不是引起NE的必要因素。这也说明还有潜在的重要致病因素存在。

实际问题 & 解决方案

坏死性肠炎临床表现 坏死性肠炎(Necrotic Enteritis)又称肠毒血症 主要原因:是由魏氏梭菌引起的一种急性传染病。 主要表现:病鸡排出黑色间或混有血液的粪便,病死鸡以小肠后段粘膜 坏死为特征。 .

临床症状 发病阶段:2周到6个月的鸡常发生坏死性肠炎,尤以2~5周龄散养肉鸡 为多。 临床症状:精神沉郁,食欲减退,不愿走动,羽毛蓬乱,病程较短,常 呈急性死亡。 .

预防和控制的方法 • 使用抗生素 • 直接饲喂具有针对抑制梭菌生长的益生菌 • 提高饲养管理水平,降低球虫病的发生率 • 使用抗生素 • 直接饲喂具有针对抑制梭菌生长的益生菌 • 提高饲养管理水平,降低球虫病的发生率 • 饲喂高质量、易吸收的日粮 • 饲料及饮水中添加有机酸 • 使用酶制剂以提高日粮的消化率 • 益生菌 • 植物提取物 • 免疫

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1 2 3 4 通过占位置,将有害菌(魏氏梭菌)位置挤掉 通过占据有利位置,将养分夺走 降低肠道PH值,抑制有害菌生长 丁酸梭菌 占位置 占养分 降低肠道PH值 生物拮抗抑制有害菌 1 通过占位置,将有害菌(魏氏梭菌)位置挤掉 2 通过占据有利位置,将养分夺走 3 降低肠道PH值,抑制有害菌生长 4 通过与其他有益菌的拮抗作用,抑制其他有害菌的生长,利于有益菌建立优势菌群

丁酸梭菌如何起作用 作用方式1:占位置。同是梭菌属,占位很明显。 有害菌 有益菌 粘附在肠粘膜上 把魏氏梭菌的位置挤掉 . 肠道上皮细胞 肠道壁 粘附在肠粘膜上 把魏氏梭菌的位置挤掉

丁酸梭菌如何起作用 作用方式2:占养分。 . 有益菌 营养物质 有害菌 肠道上皮细胞 肠道壁 把魏氏梭菌的养分夺走

丁酸梭菌如何起作用 作用方式3:降低肠道PH值。 肠道内细菌对PH的变化非常敏感,丁酸梭菌通过代谢产生大量生物 丁酸,能显著降低肠道的PH值 . 降低肠道PH

丁酸梭菌拮抗有害菌 5.1×108 1.1×109 7.6×104 6.3×105 全部数据来自中国新药杂志2002第11卷第4期 痢疾志贺菌 出血大肠杆菌 7.6×104 6.3×105 全部数据来自中国新药杂志2002第11卷第4期 1.7×109 3.6×106 沙门氏菌 霍乱弧菌 1.5×102

丁酸梭菌作用结果 作用结果:魏氏梭菌明显降低。 对照组 丁酸梭菌组 魏氏梭菌数降低95%

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