樟芝菌絲體活化巨噬細胞誘發人類肝癌細胞凋亡之分子機制探討 Induction of apoptosis in human hepatoma cells by mycelia of Antrodia camphorata via activation macrophage 指導教授：李國陽 褚俊傑 博士 學生：薛翔瑋 日期：96/07/20

大綱 前言 材料與方法 結果與討論 結論

前言

95年台灣地區10大癌症 癌 症 死 亡 原 因 順序 綜合榜 男 性 女 性 1 肺癌 肝癌 2 3 結腸直腸癌 4 乳癌 口腔癌 5 胃癌 6 食道癌 子宮頸癌 7 攝護腺癌 胰臟癌 8 非何杰金淋巴癌 9 非何杰金氏淋巴癌 膽囊癌 10 鼻咽癌 卵巢癌 出處：行政院衛生署

江詩雯, 植物多醣萃取物對肝癌與T淋巴癌細胞增殖之影響,臺北醫學大學保健營養學系碩士論文 由於大多數病人並無早期徵兆或症狀，故肝癌亦稱為無聲殺手；且肝臟位於肋骨後面，所以無法直接觸摸到細小的腫瘤硬塊，因此在腫瘤未變大時很少有疼痛感。 江詩雯, 植物多醣萃取物對肝癌與T淋巴癌細胞增殖之影響,臺北醫學大學保健營養學系碩士論文

張益軒,牛樟芝分子生物鑑定系統之研究,國立台灣大學農業化學研究所碩士論文 牛樟芝，俗稱牛樟菇、牛樟芝，學名為Antrodia camphorata。就目前所知，牛樟芝為一台灣特有菌種，生長於牛樟樹中空樹洞中，會造成樟樹產生褐腐病 。 坊間流傳，牛樟芝具有保肝、解毒能力。 子實體 菌絲體 張益軒,牛樟芝分子生物鑑定系統之研究,國立台灣大學農業化學研究所碩士論文

多醣體 多醣體是由單糖類多數結合而成，這些多醣體在構成醣的種類、化學結合方式或是分子大小與性質方面都有很大差異 β-1,3葡聚醣 李宛蓁,樟芝菌絲體培養與生理活性成分生成之研究,東海大學化學工程研究所碩士論文

主要是造成菇類苦味的原因，由三十個碳所結合而成六角或五角形之天然有機化合物總稱。 三萜類 主要是造成菇類苦味的原因，由三十個碳所結合而成六角或五角形之天然有機化合物總稱。

免疫抗腫瘤方面，發現活化作用可刺激巨噬細胞與自然殺手細胞，分泌如腫瘤壞死因子(TNF)與干擾素(IFN)等細胞激素，進而達到抑制腫瘤的作用 免疫調控 研究發現，複雜的免疫調控，主要是由淋巴球、抗原呈獻細胞等許多種類的細胞交互作用而完成，尤其是所分泌出來的細胞激素更是扮演重要角色 免疫抗腫瘤方面，發現活化作用可刺激巨噬細胞與自然殺手細胞，分泌如腫瘤壞死因子(TNF)與干擾素(IFN)等細胞激素，進而達到抑制腫瘤的作用

研究動機 找出樟芝菌絲體（低多醣體萃取液）之抗腫瘤作用做深入的研究，測定它是否具有直接的抑瘤作用，抑或是與免疫增強相關聯，繼而從細胞與分子生物學層面釐清其抗腫瘤作用之機轉。

材料與方法

材料 細胞株 野生樟芝 固態發酵樟芝菌絲體 雙態發酵樟芝菌絲體 液態樟芝多醣抽出物 HepG2 PLC/PRF/5-GFP RAW 264.7 Human hepatoblastoma BALB/c macrophage 有p53 gene 無p53 gene 有p21/WAF-1 gene 無p21/WAF-1 gene 有Fas/APO-1 無Fas/APO-1

【DPPH清除自由基】 、【螯合亞鐵離子】、【TEAC】 野生樟芝與樟芝菌絲體 （乙醇萃取液） 液態樟芝多醣抽出物 （水萃取液） 成分分析測試 【GPC】 、【HPLC】 抗氧化能力測試 【DPPH清除自由基】 、【螯合亞鐵離子】、【TEAC】 細胞株(HepG2,PLC/PRF/5,RAW264.7) 上述各種樟芝與Macrophage(RAW264.7)培養 細胞毒性測試 【MTT assay】 人類肝癌細胞株(HepG2,PLC/PRF/5) 細胞毒性測試 【MTT assay】 細胞週期觀察＆細胞凋亡分析【 Flow cytometry analysis】 RT-PCR assay 西方墨點法【 Western blotting】

樟芝乙醇萃取液與Macrophage(RAW264.7)培養＋抗癌藥物 抗癌藥物 人類肝癌細胞株(HepG2,PLC/PRF/5) 西方墨點法【 Western blotting】 細胞毒性測試 【MTT assay】 AKT PARP-1 NF-κB

結果與討論

凝膠滲透層析 （GPC assay）

凝膠滲透層析法(GPC) ：當聚合體經過層析管柱時，較小的分子較深入凝膠內部的微孔，較大的分子能滲入的孔較少或根本無法滲入。因此較小的分子滯留在管柱的時間較長，較大的分子先被溶劑帶出層析管柱，如此則可有效的分離聚合物。 GPC assay mv minute 5 10 15 500 1000 固態樟芝(酒) 雙態樟芝(酒) 野生樟芝(酒) 樟芝多醣(水) 1:多醣20000 2:多醣3000 3:多醣400 4:無多醣

高效能液相層析法 （HPLC）

高效能液相層析(HPLC) ：利用高壓溶劑的加壓來產生動力，促使液體移動相在沖提過程中帶動溶質分子流過固定相，因混合物中所含各種溶質之極性不相同，而與固定相親和力不同，因而滯留有所不同，經過整個管柱的分離後，混合物可完全分離，並由偵測器的檢測，而確定物質的存在。 野生樟芝 固態樟芝 雙態樟芝 液態樟芝 多糖抽出物

抗氧化能力測試

A B C

細胞毒性測試 （MTT assay）

樟芝對Macrophage細胞存活率測試 B C

樟芝與macrophage培養對HepG2細胞存活率測試 HepG2-24hr Macrophage(2×106)-HepG2-24hr Time Sample 24hr 2×106-24hr 2×106-48hr 野生樟芝(酒) IC50=105.55μg/ml IC50＞100μg/ml 固態樟芝(酒) IC50=77.74μg/ml IC50= 43.71μg/ml 雙態樟芝(酒) IC50= 17.31 mg/ml 樟芝多醣(水) B C

樟芝與macrophage培養對PLC/PRF/5細胞存活率測試 PLC/PRF/5-24hr Macrophage(2×106)-PLC/PRF/5-24hr Time Sample 24hr 2×106-24hr 2×106-48hr 野生樟芝(酒) IC50＞100μg/ml IC50= 6.97μg/ml IC50= 1.19μg/ml 固態樟芝(酒) IC50= 29.43μg/ml IC50= 18.43μg/ml 雙態樟芝(酒) IC50= 4.49 mg/ml 樟芝多醣(水) B C

細胞凋亡分析 （Flow Cytometry）

樟芝與Macrophage培養對HepG2細胞週期之影響 B

樟芝與Macrophage培養對HepG2細胞凋亡之影響 B

樟芝與Macrophage培養對PLC/PRF/5細胞週期之影響 B

樟芝與Macrophage培養對PLC/PRF/5細胞凋亡之影響 B

樟芝加入Macrophage培養與合併抗癌藥物對HepG2細胞凋亡之影響 B

RT-PCR

MΦ(2×106-24hr) A B 野生AC 10mg/ml 野生AC 100mg/ml 固態AC 10mg/ml LPS 2mg/ml Control TNF- α IL-1β β -actin A B

MΦ(2×106-48hr) A B 野生AC 10mg/ml 野生AC 100mg/ml 固態AC 10mg/ml LPS 2mg/ml Control TNF- α IL-1β β -actin A B

Western blot

MΦ(2×106-24hr)-HepG2-24hr MΦ(2×106-48hr)-HepG2-24hr A B 野生樟芝 10mg/ml+M Φ 野生樟芝 100mg/ml+M Φ 固態樟芝 10mg/ml+M Φ 固態樟芝100mg/ml+M Φ Control AKT NF-κB （p50） β -actin C MΦ(2×106-48hr)-HepG2-24hr D AKT NF-κB （p50） β -actin

MΦ(2×106-24hr)-PLC/PRF/5-24hr MΦ(2×106-48hr)-PLC/PRF/5-24hr A B 野生樟芝 10mg/ml+M Φ 野生樟芝 100mg/ml+M Φ 固態樟芝 10mg/ml+M Φ 固態樟芝100mg/ml+M Φ Control AKT NF-κB （p50） β -actin C MΦ(2×106-48hr)-PLC/PRF/5-24hr D AKT PARP-1 β -actin

MΦ(2×106-24hr)+合併MMC-HepG2-24hr A MΦ(2×106-24hr)+合併MMC-HepG2-24hr 野生樟芝 10mg/ml+M Φ合併MMC 1mM 固態樟芝 10mg/ml+M Φ合併MMC 1mM Control AKT B C PARP-1 NF-κB （p50） β -actin

結論

Cell cycle progression Cell survival IkB p cytokine Mf Cytokine receptor AKT JAK1 p AKT p IKK PI3K p p caspase-9 BAD p p27 p p21 NF-kB Cell cycle progression Cell survival IkB p

TNF TNFR1 FADD MMC Mf TRADD MMC AKT caspase-8,3 caspase-8,3 Apoptosis Apoptosis

Thank you for your attention

樟芝對BNL細胞存活率測試 BNL-酒 24hr 48hr 72hr 野生樟芝(酒) 固態樟芝(酒) 雙態樟芝(酒) Time Sample IC50= 115.48μg/ml IC50= 138.2μg/ml IC50= 105.55μg/ml 固態樟芝(酒) IC50= 1.07 mg/ml IC50= 1.33 mg/ml IC50= 2.99 mg/ml 雙態樟芝(酒) IC50= 2.69 mg/ml IC50= 3.71 mg/ml IC50= 5.73 mg/ml

樟芝與macrophage培養對BNL細胞存活率測試 BNL-24hr Macrophage(2×106)-BNL-24hr Time Sample 24hr 2×106-24hr 2×106-48hr 野生樟芝(酒) IC50= 115.48μg/ml IC50= 21.67μg/ml IC50= 22.88μg/ml 固態樟芝(酒) IC50= 1.07 mg/ml IC50= 111.4μg/ml IC50= 119.71μg/ml 雙態樟芝(酒) IC50= 2.69 mg/ml IC50＞1000μg/ml 樟芝多醣(水) IC50＞100μg/ml IC50=19.99μg/ml

篩選macrophage細胞數