红细胞计数、红细胞形态检查、血红蛋白测定 检验系临检教研室 陈丽华

目的要求 1.掌握：①红细胞计数、氰化高铁血红蛋白测定的原理、方法、质量控制、参考值、方法学平价及临床意义 ； ②红细胞形态。 2.了解：血红蛋白测定其他方法 。

目的要求 重点 :红细胞计数、血红蛋白测定的原理、血片 红细胞形态、 难点:红细胞检验的形态、质控。

一、概 述

1.红细胞的生成 Epo 骨髓造血干细胞---------红系祖细胞--------原红细胞---- 早幼----中幼----晚幼------网织红细胞--------成熟红细胞 无分裂能力 48h 每个原红细胞可以生成16个红细胞。

2.红细胞的破坏 健康人红细胞平均寿命120天。 红细胞主要因衰老而消亡，破坏主要在单核-巨噬细胞系统，器官主要是在脾脏和肝脏；其次为骨髓和其他部位。

二、红细胞计数

红细胞计数（red blood cell count,RBC）即测定单位体积内红细胞数量。是血液一般检验的基本项目，常作为诊断贫血和红细胞增多的主要指标之一。 显微镜计数法 测定方法 血液分析仪法

（一）显微镜计数法 【检测原理】 采用等渗稀释液将血标本稀释一定倍数，滴入血细胞计数室中，显微镜下计数一定区域内红细胞数，经换算得每升血液中红细胞数量。

【器材】 微量吸管，采血针，小试管，计数板，盖片，棉球，显微镜。 【试剂】红细胞稀释液：任选一种 1.Hayem稀释液：氯化钠1.0g、硫酸钠（含10个结晶水）5.0g，氯化高汞0.5g，蒸馏水加至200mL，过滤后使用。 氯化钠---调节渗透浓度 硫酸钠---提高比重防止红细胞粘连 氯化高汞---防腐剂，有毒

2.柠檬酸盐甲醛盐水 氯化钠 0.6g 调节渗透压 柠檬酸钠 1.0g 调节渗透压，抗凝 36%甲醛 1ml 防腐 蒸馏水加至100ml，过滤2次后使用。 3.生理盐水或加1%甲醛的生理盐水

【操作】 1.中号试管（15×100mm）加等渗稀释液2ml； 2.毛细血管采末梢血10μl加入上述稀释液，立即摇匀（稀释200倍）； 3.充池，静置2min后以低倍镜计数中间大方格内四角和中央5个中方格内的红细胞数。 未染色红细胞呈双凹盘形，有黄绿色折光。

红细胞计数 2ml稀释液 充分混匀 10ul血液 充池、静止 镜下计数

3mm WBC WBC WBC WBC 1mm

【计算】 红细胞数/L=5个中方格内红细胞×5 ×10 ×200 ×106/L 或 = ×1012/L 5个中方格内红细胞数 100 【报告方式】 RBC（/L）= . × 1012/L

【方法学评价】 1．手工显微镜法 2．血液分析仪法 为目前主要临床检验细胞计数方法 变异系数（coefficient of variation, CV ）小。

【质量控制】 1．手工法 误差来源包括：标本、操作、器材、固有误差（计数域误差） 2．仪器法 严格按操作规程；定期作室内和室间质控。

【参考值】 男性 : （4.00-5.50） × 1012/L 女性 : （3.50-5.00） × 1012/L 新生儿:（6.00-7.00） × 1012/L 【校正】WBC>100×109/L时，需校正： 实际红细胞/L=所数细胞总数－白细胞数 （正常红细胞：白细胞=750：1, 可忽略白细胞的影响）

【注意事项】 1.采血及摇匀迅速，防止血液凝固； 2.器械应防酸防碱且干燥； 3.充池要摇匀； 4.计数时，应识别酵母及白细胞。

三、血红蛋白测定

（一）血红蛋白的结构 血红蛋白结构： 由珠蛋白和亚铁血红素结合组成。 Hb 色素部分：亚铁血红素 蛋白质部分：珠蛋白 Fe 2+ 原卟啉

空间结构：每个血红蛋白有4条珠蛋白肽链， 每条肽链包裹1个亚铁血红素，形成具有 四级空间结构的四聚体。

【分类】（每个珠蛋白分子含两条α 链和两条非α 链） 正常人：HbA （ α2β2） 占90% 成人主要血红蛋白； HbA2（ α2δ2 ） 占2%-3% 成人次要血红蛋白 HbF （ α2γ2 ） 占2%以下 胎儿主要血红蛋白

生理情况下，99%Hb的铁呈Fe2+状态，称为还原血红蛋白，亚铁状态的Hb与氧结合称氧合血红蛋白（HbO2). 1%Hb的铁呈Fe3+状态，称为高铁血红蛋白（Hi）。 Hb的合成受激素的调节：Epo和雄激素。

注意事项：1. 如α-链或β-链合成障碍，使三种正常血红蛋白比例异常，即各型地中海贫血；如多肽链发生氨基酸置换、丢失、加长，称为血红蛋白病 。 2.病理情况下可出现硫化血红蛋白（SHb）。

（二）血红蛋白衍生物及其吸收光谱 1.氧合血红蛋白（oxyhemoglobin, HbO2）:Hb与O2结合时形成。 2.还原血红蛋白（reduced hemoglobin, Hbred）：未与O2结合时的Hb。 3.高铁血红蛋白（hemiglo -bin, Hi）或正铁血红蛋白（methemoglobin, Mhb）: Fe 2+被氧化成Fe 3+。

4.碳氧血红蛋白（HbCO）、硫化血红蛋白（SHb）：与O2结合的配位键被CO、S等占据。 5.氰化高铁血红蛋白（HiCN）：Hi与CN-结合而成。波峰540nm，波谷504nm。 正常情况下，血液中血红蛋白主要是HbO2和Hbred，以及少量HbCO和Hi。

（三）血红蛋白测定方法 HiCN法 SLS-Hb法 手工法： AHD575法 HiN3法 血液分析仪法

1、氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定法 1）原理：在Hb转化液中，除SHb外，Hb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与CN-结合，生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白（HiCN），吸收峰为λ540nm，毫摩尔消光系数为44 L·mmol-1 ·cm -1 。因此根据标本的吸光度，即可求得血红蛋白总量（不含SHb）。

2）器材： 分光光度计、移液管、微量吸管、试管等。 3）试剂：血红蛋白转化液（文齐液）成分如下 ①高铁氰化钾：使Hb转化成Hi ②氰化钾：使Hi形成HiCN ③无水磷酸二氢钾：防止混浊，调节pH值 ④TritonX100:非离子型表面活性剂，加速溶血，缩短转化时间，防止因血浆蛋白改变引起的混浊。

4）操作： a. 取指血20ul，加到5ml血红蛋白转化液中，混匀，静置5分钟。 b. 用分光光度计比色。波长540nm，以空白转化液调零，测定吸光度“A”。

5）计算 ①标准状态下的计算 Hb（g/L）=A× ×251＝A ×367.7 其中，A为测得的吸光度，64458为Hb的分子量， 251为测定时血液稀释倍数，44为HiCN的毫摩尔吸光系数，×1000为换算成摩尔吸光系数。 64458 44×1000

②非标准状态下的计算：求换算常数K ∑标准液标定Hb液浓度 (标准值) K= ----------------------------------------------- ∑本室测定标准液的“A” (测定值) 标本Hb g/L = 标本测定值A×Ｋ

举例：用不同浓度的Hb的标准品：50，100，150，200g/L测得的吸光度分别为0.13, 0.27, 0.41和0.54 。则K值为 50+100+150+200 ∑A 0.13+0.27+0.41+0.54

6)结果报告 Hb g/L 7)参考值 成年男性：120-160 g/L 成年女性：110-150 g/L 新生儿： 170-200 g/L

贫血分级： 轻度：男性<120g/L,女性<110g/L 中度： <90g/L 重点： <60g/L 极重度：<30g/L

8）质量保证 废弃物：KCN为剧毒药品，要小心对待，实验完后要用次氯酸钠溶液处理后才能弃倒。 b. 器材及试剂：血红蛋白转化液不能贮存在塑料瓶中，否则CN-下降使结果偏低。 c. 标本：下列因素可引起Hb假性增高：脂血症、血液浓缩、白细胞>30×109/L，重症黄疸，严重的血管内溶血等。

2、方法学评价 1）HiCN法：由国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐，并经WHO确认为血红蛋白测定的参考方法。 优点：①操作简单，结果稳定可靠，试剂容易保存 ②能测定除SHb以外的所有血红蛋白，并易 于建立质控。

缺点：①不能测定SHb。 ②对HbCO转化太慢，需要100分钟。 ③高丙种球蛋白血症，变性Hb血症，高白细胞的血可出现混浊，按15g/L（pH7.2~7.5）甚至50g/L（pH6.7~6.9）加入氯化钠可防止，高浓度有核RBC引起的混浊不能防止。 ④KCN为剧毒，需妥善保存。

2)SDS-Hb（十二烷基硫酸钠）法 优点：试剂无毒，结果准确，重复性好 缺点：①SDS纯度难保证； ②依赖HiCN法，间接得到结果； ③试剂可破坏WBC，不能与WBC同时共用标本进行血细胞计数的自动分析。

3）叠氮高铁血红蛋白法（HiN3） 优点：准确度、精密度较高 缺点：试剂仍有毒性，HbCO转化慢 本法与HiCN法相似

4）碱羟血红蛋白法（AHD575） 优点：试剂简易，不含毒性，呈色稳定，准确性与精确性较高。 缺点:波峰位于575nm处，溶液中碱性较高，不适用于自动检测，HbF不能转化。

5）CTAB法 优点：溶血性强且不破坏白细胞，适于血液分析仪检测。 缺点：精密度、准确度略低。 沙利法为传统血红蛋白测定法，已淘汰。

6）血液分析仪法 优点：简便、快速、多项。 缺点：①仪器型号不同，使用的溶血剂不同，形成的Hb衍生物不同。

③对具有抗溶血剂作用的疾病（肝病、低色素性贫血），溶血不完全而影响结果。 ④有些溶血剂内虽加入了KCN，但其衍生物并非HiCN，而是氰化血红蛋白，仪器需经过HiCN标准液校正后，才能进行Hb测定。

（四）Hb与RBC测定的临床意义 参考值 RBC Hb 男性 （4.0~5.5）×1012/L 120~160g/L

（1）生理变化 1）年龄与性别 ①新生儿 ②6个月~2岁婴儿 ，生长发育迅速，血容量 造血原料不足，引起生理性贫血。 ②6个月~2岁婴儿 ，生长发育迅速，血容量 造血原料不足，引起生理性贫血。 ③老年人 ：对营养摄取、利用和造血功能减退，RBC、Hb比中青年人低。 ④男性>女性：雄激素

2）精神因素：情绪波动，使肾上腺素增多，RBC、Hb 3）气压：气压低（高山居民），红细胞代偿性 4）长期多次献血者，红细胞代偿 5）妊娠期 ：妊娠期血容量明显 ，引起血液稀释，Hb常在100g/L以下，生理性贫血。

（2）病理变化 1）RBC和Hb增多 指单位容积血液中红细胞数值及血红蛋白含量高于正常值高限。 男性 Hb >170g/L 女性 Hb >160g/L RBC >6.0×1012/L RBC >5.5×1012/L

①相对性增多：由于大量失水、血浆量下降而使血液浓缩所致，如呕吐、严重腹泻、大面积烧伤等。 ②绝对性增多：见于慢性心肺疾病，真性红细胞增多症。

2）红细胞和Hb减少：贫血 ①骨髓造血功能低下：如再障、白血病、恶性肿瘤 ②造血原料缺乏：如缺铁、叶酸、VB12等； ③红细胞破坏增加：如各种溶血性贫血； ④红细胞丢失过多：如急、慢性失血； ⑤促红细胞生成素减低症（肾性贫血） Hb测定与红细胞计数的临床意义相似，但对贫血 程度判断的准确性优于红细胞计数。

Hb含量与RBC数量的关系 红细胞与血红蛋白的增减不一定成比例，如大细胞 性贫血患者的RBC往往较Hb减少显著；而小细胞性贫血患者则相反。

四、红细胞的形态检查

概述 各种原因可作用于红细胞生理进程的不同阶段，从而引起红细胞相应的病理变化，导致某些类型贫血的红细胞发生形态学变化，这些变化包括红细胞的大小、形状、染色性质和内含物的异常，因此RBC形态检查常作为追踪贫血线索的一项重要检查内容，对贫血的诊断和鉴别诊断有重要的临床价值。

【方法及评价】 1.显微镜分析法：是仪器法校准的参考方法； 2.计算机图像分析：能快速自动以正常红细胞形态为参考，按红细胞形态特征做出类型和比例统计分析，可用于RBC形态变化相关疾病的辅助诊断； 3.血液分析仪法：不能直接提供红细胞形态改变的确切信息，需用镜检血涂片核实。 注意：如果血片制作不良和染色不佳，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。

【质量控制】 选择细胞分布均匀的区域： 红细胞堆积棒状穿钱状：细胞过于密集。但如果在血涂片较薄的区域出现，可能是红细胞外附有异型球蛋白  注意完整的检查 顺序。减少人为 因素影响。

人为原因造成红细胞形态异常 1.涂片不当：出现棘形红细胞、邹缩RBC、红细胞缗钱状形成等。 2.使用非疏水性玻片：口型RBC。 4.抗凝剂EDTA过高，或长时间放置血液：锯齿状RBC。 5.涂片干燥过慢，或由于固定液中混有少许水分:面包圈形RBC。 6.涂片末端附近：长轴方向一致的假椭圆形RBC。

（一）正常红细胞形态（染色后） 红细胞直径6.7~7.7um,平均直径为7.2um。桔红色，向心性淡染，中心苍白，淡染区约为红细胞直径的1/3。 意义：正常人、再障、白血病、急性失血可见正常形态。

（二）大小异常 1. 红细胞大小不均（anisocytosis） 红细胞直径相差一倍以上，常见于各种重症增 生性贫血，尤其见于重症巨幼细胞贫血。

2.小红细胞（microcyte） 直径小于6um者称为小红细胞，正常人偶见。提示血红蛋白合成障碍，可能由于缺铁和珠蛋白代谢异常所致。见于缺铁性贫血和珠蛋白生成障碍性贫血。常伴有中心浅染区扩大。

3.大红细胞（macrocyte） 直径大于10um，见于溶血性贫血（由于不全成熟的红细胞增多）及巨幼红细胞性贫血（是由于叶酸或维生素B12缺乏，DNA合成障碍，血红蛋白合成过剩，脱核后形成大红细胞或巨红细胞）。

红细胞大小不一

红细胞大小不一

4.巨红细胞（megalocyte） 直径大于15um，见于巨幼细胞贫血。细胞中心浅 染区消失。

巨幼贫 Macrocyte anisocytosis microcyte megalocyte 低色素性贫血、溶贫、失贫、巨幼贫等增生性贫血。 ① 小细胞低色素多（缺铁、地贫） ② 单纯小红细胞 溶贫、急性失血、巨幼贫

（三）形态异常 1. 球形红细胞（spherocyte） 球形红细胞直径小于正常，厚度增加常大于2um，无中心浅染区，似球形。常见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病及红细胞酶缺陷所致溶血性贫血等。

2.椭圆形红细胞（elliptocyte） 椭圆形红细胞呈卵圆形、杆形，长度可大于宽度 3-4倍，是细胞膜缺陷所致，在遗传形椭圆形红细胞增多症病人血涂片中此细胞可在25%以上。

3.靶形红细胞（target cell） 中心区和细胞周缘染色深，其间为不染色的苍白环。是由于H b含量不足而且分布不均。见于低色素性贫血，尤其是珠蛋白生成障碍性贫血。

4.棘形红细胞（acanthocyte） 红细胞表面有刺状突起，大小不一、形态各异。 常见于遗传性β脂蛋白缺乏症及脾切除、酒精中毒性肝病、尿毒症。

5.镰形红细胞（sickle cell） 红细胞形如镰刀状，由于红细胞内存在HbS所致。主要见于镰形红细胞性贫血。

6.口形红细胞（stomatocyte） 红细胞中心苍白区呈扁平状，形如一个微张开的鱼口。DIC及酒精中毒时可见少量此类细胞。

7.裂片细胞（schistocyte） 为红细胞破坏后的碎片，大小不一，形态各异，边缘不规则。在微血管病性溶血性贫血如DIC时此类细胞增多。

8.红细胞形态不齐（poikilocytosis）: 红细胞形态发生多种明显该变，可呈梨形、泪滴形、新月形、三角形等。最常见于巨幼贫。

（四）染色异常 1. 低色素性（hypochromatic）红细胞：血红蛋白含量低，中心浅染区扩大。常见于缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血。

2.高色素性红细胞（hyperchromatic）：血红蛋白含量高，染色深，中心浅染区缩小或消失。见于巨幼细胞贫血和遗传性球形红细胞增多症。

（12）双相性红细胞

3.嗜多色性（polychromatic）细胞：属于尚未完全成熟的红细胞，细胞较大，由于胞浆中含有多少不等的嗜碱性物质RNA而被染成灰蓝色。见于白血病、溶血性贫血。

地贫 hypochromic polychromatic 巨幼贫、球红增多症 hyperchromic 缺铁、 红细胞呈淡灰兰色或紫色，体 积较正常稍大，属于未完全熟 细胞。活体染色即网织红细胞增 多，增生性贫血。

（五）结构异常 1. 嗜碱性点彩红细胞（basophilic stippling cell ）： 指在瑞氏染色下，胞浆内存在嗜碱性黑蓝色颗粒的红细胞，属于未完全成熟红细胞，颗粒大小不一、多少不均。常作为铅中毒诊断筛选指标。

嗜碱性点彩红细胞

2. 染色质小体（Howell-Jolly body）：位于成熟或幼红细胞的胞浆中圆形，1-2um，紫色，为核残余物，常见于巨幼细胞贫血、溶血性贫血等。

3.卡波氏环（Cabot ring）： 在成熟或幼稚红细胞胞质内，呈紫红色线圈状或8字形，可能是胞浆中脂蛋白变性，见于巨幼细胞性贫血和铅中毒。

4.有核红细胞（nucleated erythrocyte）：即幼稚红细胞，出现在外周血为病理现象，见于各种溶血性贫血、白血病。

有核红细胞

（六）寄生虫：疟原虫、微丝蚴、杜利什曼原虫感染时可见红细胞质内相应病原体。

谢谢