红细胞计数、红细胞形态检查、血红蛋白测定

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红细胞计数、红细胞形态检查、血红蛋白测定 检验系临检教研室 陈丽华

目的要求 1.掌握:①红细胞计数、氰化高铁血红蛋白测定的原理、方法、质量控制、参考值、方法学平价及临床意义 ; ②红细胞形态。 2.了解:血红蛋白测定其他方法 。

目的要求 重点 :红细胞计数、血红蛋白测定的原理、血片 红细胞形态、 难点:红细胞检验的形态、质控。

一、概 述

1.红细胞的生成 Epo 骨髓造血干细胞---------红系祖细胞--------原红细胞---- 早幼----中幼----晚幼------网织红细胞--------成熟红细胞 无分裂能力 48h 每个原红细胞可以生成16个红细胞。

2.红细胞的破坏 健康人红细胞平均寿命120天。 红细胞主要因衰老而消亡,破坏主要在单核-巨噬细胞系统,器官主要是在脾脏和肝脏;其次为骨髓和其他部位。

二、红细胞计数

红细胞计数(red blood cell count,RBC)即测定单位体积内红细胞数量。是血液一般检验的基本项目,常作为诊断贫血和红细胞增多的主要指标之一。 显微镜计数法 测定方法 血液分析仪法

(一)显微镜计数法 【检测原理】 采用等渗稀释液将血标本稀释一定倍数,滴入血细胞计数室中,显微镜下计数一定区域内红细胞数,经换算得每升血液中红细胞数量。

【器材】 微量吸管,采血针,小试管,计数板,盖片,棉球,显微镜。 【试剂】红细胞稀释液:任选一种 1.Hayem稀释液:氯化钠1.0g、硫酸钠(含10个结晶水)5.0g,氯化高汞0.5g,蒸馏水加至200mL,过滤后使用。 氯化钠---调节渗透浓度 硫酸钠---提高比重防止红细胞粘连 氯化高汞---防腐剂,有毒

2.柠檬酸盐甲醛盐水 氯化钠 0.6g 调节渗透压 柠檬酸钠 1.0g 调节渗透压,抗凝 36%甲醛 1ml 防腐 蒸馏水加至100ml,过滤2次后使用。 3.生理盐水或加1%甲醛的生理盐水

【操作】 1.中号试管(15×100mm)加等渗稀释液2ml; 2.毛细血管采末梢血10μl加入上述稀释液,立即摇匀(稀释200倍); 3.充池,静置2min后以低倍镜计数中间大方格内四角和中央5个中方格内的红细胞数。 未染色红细胞呈双凹盘形,有黄绿色折光。

红细胞计数 2ml稀释液 充分混匀 10ul血液 充池、静止 镜下计数

3mm WBC WBC WBC WBC 1mm

【计算】 红细胞数/L=5个中方格内红细胞×5 ×10 ×200 ×106/L 或 = ×1012/L 5个中方格内红细胞数 100 【报告方式】 RBC(/L)= . × 1012/L

【方法学评价】 1.手工显微镜法 2.血液分析仪法 为目前主要临床检验细胞计数方法 变异系数(coefficient of variation, CV )小。

【质量控制】 1.手工法 误差来源包括:标本、操作、器材、固有误差(计数域误差) 2.仪器法 严格按操作规程;定期作室内和室间质控。

【参考值】 男性 : (4.00-5.50) × 1012/L 女性 : (3.50-5.00) × 1012/L 新生儿:(6.00-7.00) × 1012/L 【校正】WBC>100×109/L时,需校正: 实际红细胞/L=所数细胞总数-白细胞数 (正常红细胞:白细胞=750:1, 可忽略白细胞的影响)

【注意事项】 1.采血及摇匀迅速,防止血液凝固; 2.器械应防酸防碱且干燥; 3.充池要摇匀; 4.计数时,应识别酵母及白细胞。

三、血红蛋白测定

(一)血红蛋白的结构 血红蛋白结构: 由珠蛋白和亚铁血红素结合组成。 Hb 色素部分:亚铁血红素 蛋白质部分:珠蛋白 Fe 2+ 原卟啉

空间结构:每个血红蛋白有4条珠蛋白肽链, 每条肽链包裹1个亚铁血红素,形成具有 四级空间结构的四聚体。

【分类】(每个珠蛋白分子含两条α 链和两条非α 链) 正常人:HbA ( α2β2) 占90% 成人主要血红蛋白; HbA2( α2δ2 ) 占2%-3% 成人次要血红蛋白 HbF ( α2γ2 ) 占2%以下 胎儿主要血红蛋白

生理情况下,99%Hb的铁呈Fe2+状态,称为还原血红蛋白,亚铁状态的Hb与氧结合称氧合血红蛋白(HbO2). 1%Hb的铁呈Fe3+状态,称为高铁血红蛋白(Hi)。 Hb的合成受激素的调节:Epo和雄激素。

注意事项:1. 如α-链或β-链合成障碍,使三种正常血红蛋白比例异常,即各型地中海贫血;如多肽链发生氨基酸置换、丢失、加长,称为血红蛋白病 。 2.病理情况下可出现硫化血红蛋白(SHb)。

(二)血红蛋白衍生物及其吸收光谱 1.氧合血红蛋白(oxyhemoglobin, HbO2):Hb与O2结合时形成。 2.还原血红蛋白(reduced hemoglobin, Hbred):未与O2结合时的Hb。 3.高铁血红蛋白(hemiglo -bin, Hi)或正铁血红蛋白(methemoglobin, Mhb): Fe 2+被氧化成Fe 3+。

4.碳氧血红蛋白(HbCO)、硫化血红蛋白(SHb):与O2结合的配位键被CO、S等占据。 5.氰化高铁血红蛋白(HiCN):Hi与CN-结合而成。波峰540nm,波谷504nm。 正常情况下,血液中血红蛋白主要是HbO2和Hbred,以及少量HbCO和Hi。

(三)血红蛋白测定方法 HiCN法 SLS-Hb法 手工法: AHD575法 HiN3法 血液分析仪法

1、氰化高铁血红蛋白(HiCN)测定法 1)原理:在Hb转化液中,除SHb外,Hb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白,再与CN-结合,生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白(HiCN),吸收峰为λ540nm,毫摩尔消光系数为44 L·mmol-1 ·cm -1 。因此根据标本的吸光度,即可求得血红蛋白总量(不含SHb)。

2)器材: 分光光度计、移液管、微量吸管、试管等。 3)试剂:血红蛋白转化液(文齐液)成分如下 ①高铁氰化钾:使Hb转化成Hi ②氰化钾:使Hi形成HiCN ③无水磷酸二氢钾:防止混浊,调节pH值 ④TritonX100:非离子型表面活性剂,加速溶血,缩短转化时间,防止因血浆蛋白改变引起的混浊。

4)操作: a. 取指血20ul,加到5ml血红蛋白转化液中,混匀,静置5分钟。 b. 用分光光度计比色。波长540nm,以空白转化液调零,测定吸光度“A”。

5)计算 ①标准状态下的计算 Hb(g/L)=A× ×251=A ×367.7 其中,A为测得的吸光度,64458为Hb的分子量, 251为测定时血液稀释倍数,44为HiCN的毫摩尔吸光系数,×1000为换算成摩尔吸光系数。 64458 44×1000

②非标准状态下的计算:求换算常数K ∑标准液标定Hb液浓度 (标准值) K= ----------------------------------------------- ∑本室测定标准液的“A” (测定值) 标本Hb g/L = 标本测定值A×K

举例:用不同浓度的Hb的标准品:50,100,150,200g/L测得的吸光度分别为0.13, 0.27, 0.41和0.54 。则K值为 50+100+150+200 ∑A 0.13+0.27+0.41+0.54

6)结果报告 Hb g/L 7)参考值 成年男性:120-160 g/L 成年女性:110-150 g/L 新生儿: 170-200 g/L

贫血分级: 轻度:男性<120g/L,女性<110g/L 中度: <90g/L 重点: <60g/L 极重度:<30g/L

8)质量保证 废弃物:KCN为剧毒药品,要小心对待,实验完后要用次氯酸钠溶液处理后才能弃倒。 b. 器材及试剂:血红蛋白转化液不能贮存在塑料瓶中,否则CN-下降使结果偏低。 c. 标本:下列因素可引起Hb假性增高:脂血症、血液浓缩、白细胞>30×109/L,重症黄疸,严重的血管内溶血等。

2、方法学评价 1)HiCN法:由国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐,并经WHO确认为血红蛋白测定的参考方法。 优点:①操作简单,结果稳定可靠,试剂容易保存 ②能测定除SHb以外的所有血红蛋白,并易 于建立质控。

缺点:①不能测定SHb。 ②对HbCO转化太慢,需要100分钟。 ③高丙种球蛋白血症,变性Hb血症,高白细胞的血可出现混浊,按15g/L(pH7.2~7.5)甚至50g/L(pH6.7~6.9)加入氯化钠可防止,高浓度有核RBC引起的混浊不能防止。 ④KCN为剧毒,需妥善保存。

2)SDS-Hb(十二烷基硫酸钠)法 优点:试剂无毒,结果准确,重复性好 缺点:①SDS纯度难保证; ②依赖HiCN法,间接得到结果; ③试剂可破坏WBC,不能与WBC同时共用标本进行血细胞计数的自动分析。

3)叠氮高铁血红蛋白法(HiN3) 优点:准确度、精密度较高 缺点:试剂仍有毒性,HbCO转化慢 本法与HiCN法相似

4)碱羟血红蛋白法(AHD575) 优点:试剂简易,不含毒性,呈色稳定,准确性与精确性较高。 缺点:波峰位于575nm处,溶液中碱性较高,不适用于自动检测,HbF不能转化。

5)CTAB法 优点:溶血性强且不破坏白细胞,适于血液分析仪检测。 缺点:精密度、准确度略低。 沙利法为传统血红蛋白测定法,已淘汰。

6)血液分析仪法 优点:简便、快速、多项。 缺点:①仪器型号不同,使用的溶血剂不同,形成的Hb衍生物不同。

③对具有抗溶血剂作用的疾病(肝病、低色素性贫血),溶血不完全而影响结果。 ④有些溶血剂内虽加入了KCN,但其衍生物并非HiCN,而是氰化血红蛋白,仪器需经过HiCN标准液校正后,才能进行Hb测定。

(四)Hb与RBC测定的临床意义 参考值 RBC Hb 男性 (4.0~5.5)×1012/L 120~160g/L

(1)生理变化 1)年龄与性别 ①新生儿 ②6个月~2岁婴儿 ,生长发育迅速,血容量 造血原料不足,引起生理性贫血。 ②6个月~2岁婴儿 ,生长发育迅速,血容量 造血原料不足,引起生理性贫血。 ③老年人 :对营养摄取、利用和造血功能减退,RBC、Hb比中青年人低。 ④男性>女性:雄激素

2)精神因素:情绪波动,使肾上腺素增多,RBC、Hb 3)气压:气压低(高山居民),红细胞代偿性 4)长期多次献血者,红细胞代偿 5)妊娠期 :妊娠期血容量明显 ,引起血液稀释,Hb常在100g/L以下,生理性贫血。

(2)病理变化 1)RBC和Hb增多 指单位容积血液中红细胞数值及血红蛋白含量高于正常值高限。 男性 Hb >170g/L 女性 Hb >160g/L RBC >6.0×1012/L RBC >5.5×1012/L

①相对性增多:由于大量失水、血浆量下降而使血液浓缩所致,如呕吐、严重腹泻、大面积烧伤等。 ②绝对性增多:见于慢性心肺疾病,真性红细胞增多症。

2)红细胞和Hb减少:贫血 ①骨髓造血功能低下:如再障、白血病、恶性肿瘤 ②造血原料缺乏:如缺铁、叶酸、VB12等; ③红细胞破坏增加:如各种溶血性贫血; ④红细胞丢失过多:如急、慢性失血; ⑤促红细胞生成素减低症(肾性贫血) Hb测定与红细胞计数的临床意义相似,但对贫血 程度判断的准确性优于红细胞计数。

Hb含量与RBC数量的关系 红细胞与血红蛋白的增减不一定成比例,如大细胞 性贫血患者的RBC往往较Hb减少显著;而小细胞性贫血患者则相反。

四、红细胞的形态检查

概述 各种原因可作用于红细胞生理进程的不同阶段,从而引起红细胞相应的病理变化,导致某些类型贫血的红细胞发生形态学变化,这些变化包括红细胞的大小、形状、染色性质和内含物的异常,因此RBC形态检查常作为追踪贫血线索的一项重要检查内容,对贫血的诊断和鉴别诊断有重要的临床价值。

【方法及评价】 1.显微镜分析法:是仪器法校准的参考方法; 2.计算机图像分析:能快速自动以正常红细胞形态为参考,按红细胞形态特征做出类型和比例统计分析,可用于RBC形态变化相关疾病的辅助诊断; 3.血液分析仪法:不能直接提供红细胞形态改变的确切信息,需用镜检血涂片核实。 注意:如果血片制作不良和染色不佳,常使细胞鉴别发生困难,甚至导致错误结论。

【质量控制】 选择细胞分布均匀的区域: 红细胞堆积棒状穿钱状:细胞过于密集。但如果在血涂片较薄的区域出现,可能是红细胞外附有异型球蛋白  注意完整的检查 顺序。减少人为 因素影响。

人为原因造成红细胞形态异常 1.涂片不当:出现棘形红细胞、邹缩RBC、红细胞缗钱状形成等。 2.使用非疏水性玻片:口型RBC。 4.抗凝剂EDTA过高,或长时间放置血液:锯齿状RBC。 5.涂片干燥过慢,或由于固定液中混有少许水分:面包圈形RBC。 6.涂片末端附近:长轴方向一致的假椭圆形RBC。

(一)正常红细胞形态(染色后) 红细胞直径6.7~7.7um,平均直径为7.2um。桔红色,向心性淡染,中心苍白,淡染区约为红细胞直径的1/3。 意义:正常人、再障、白血病、急性失血可见正常形态。

(二)大小异常 1. 红细胞大小不均(anisocytosis) 红细胞直径相差一倍以上,常见于各种重症增 生性贫血,尤其见于重症巨幼细胞贫血。

2.小红细胞(microcyte) 直径小于6um者称为小红细胞,正常人偶见。提示血红蛋白合成障碍,可能由于缺铁和珠蛋白代谢异常所致。见于缺铁性贫血和珠蛋白生成障碍性贫血。常伴有中心浅染区扩大。

3.大红细胞(macrocyte) 直径大于10um,见于溶血性贫血(由于不全成熟的红细胞增多)及巨幼红细胞性贫血(是由于叶酸或维生素B12缺乏,DNA合成障碍,血红蛋白合成过剩,脱核后形成大红细胞或巨红细胞)。

红细胞大小不一

红细胞大小不一

4.巨红细胞(megalocyte) 直径大于15um,见于巨幼细胞贫血。细胞中心浅 染区消失。

巨幼贫 Macrocyte anisocytosis microcyte megalocyte 低色素性贫血、溶贫、失贫、巨幼贫等增生性贫血。 ① 小细胞低色素多(缺铁、地贫) ② 单纯小红细胞 溶贫、急性失血、巨幼贫

(三)形态异常 1. 球形红细胞(spherocyte) 球形红细胞直径小于正常,厚度增加常大于2um,无中心浅染区,似球形。常见于遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病及红细胞酶缺陷所致溶血性贫血等。

2.椭圆形红细胞(elliptocyte) 椭圆形红细胞呈卵圆形、杆形,长度可大于宽度 3-4倍,是细胞膜缺陷所致,在遗传形椭圆形红细胞增多症病人血涂片中此细胞可在25%以上。

3.靶形红细胞(target cell) 中心区和细胞周缘染色深,其间为不染色的苍白环。是由于H b含量不足而且分布不均。见于低色素性贫血,尤其是珠蛋白生成障碍性贫血。

4.棘形红细胞(acanthocyte) 红细胞表面有刺状突起,大小不一、形态各异。 常见于遗传性β脂蛋白缺乏症及脾切除、酒精中毒性肝病、尿毒症。

5.镰形红细胞(sickle cell) 红细胞形如镰刀状,由于红细胞内存在HbS所致。主要见于镰形红细胞性贫血。

6.口形红细胞(stomatocyte) 红细胞中心苍白区呈扁平状,形如一个微张开的鱼口。DIC及酒精中毒时可见少量此类细胞。

7.裂片细胞(schistocyte) 为红细胞破坏后的碎片,大小不一,形态各异,边缘不规则。在微血管病性溶血性贫血如DIC时此类细胞增多。

8.红细胞形态不齐(poikilocytosis): 红细胞形态发生多种明显该变,可呈梨形、泪滴形、新月形、三角形等。最常见于巨幼贫。

(四)染色异常 1. 低色素性(hypochromatic)红细胞:血红蛋白含量低,中心浅染区扩大。常见于缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血。

2.高色素性红细胞(hyperchromatic):血红蛋白含量高,染色深,中心浅染区缩小或消失。见于巨幼细胞贫血和遗传性球形红细胞增多症。

(12)双相性红细胞

3.嗜多色性(polychromatic)细胞:属于尚未完全成熟的红细胞,细胞较大,由于胞浆中含有多少不等的嗜碱性物质RNA而被染成灰蓝色。见于白血病、溶血性贫血。

地贫 hypochromic polychromatic 巨幼贫、球红增多症 hyperchromic 缺铁、 红细胞呈淡灰兰色或紫色,体 积较正常稍大,属于未完全熟 细胞。活体染色即网织红细胞增 多,增生性贫血。

(五)结构异常 1. 嗜碱性点彩红细胞(basophilic stippling cell ): 指在瑞氏染色下,胞浆内存在嗜碱性黑蓝色颗粒的红细胞,属于未完全成熟红细胞,颗粒大小不一、多少不均。常作为铅中毒诊断筛选指标。

嗜碱性点彩红细胞

2. 染色质小体(Howell-Jolly body):位于成熟或幼红细胞的胞浆中圆形,1-2um,紫色,为核残余物,常见于巨幼细胞贫血、溶血性贫血等。

3.卡波氏环(Cabot ring): 在成熟或幼稚红细胞胞质内,呈紫红色线圈状或8字形,可能是胞浆中脂蛋白变性,见于巨幼细胞性贫血和铅中毒。

4.有核红细胞(nucleated erythrocyte):即幼稚红细胞,出现在外周血为病理现象,见于各种溶血性贫血、白血病。

有核红细胞

(六)寄生虫:疟原虫、微丝蚴、杜利什曼原虫感染时可见红细胞质内相应病原体。

谢谢